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(無題) 削除/引用 No.11480-6 - 2023/06/02 (金) 03:42:00 - あの 気になる点は次です 　細胞ならPFA固定は、１分かより短くてもよいはず。 　Triton 処理の後に細胞は残っているか？細胞が洗い流されていないか？ 　シグナルが弱くて、共焦点顕微鏡で観察する必要があるのではないか？

(無題) 削除/引用 No.11480-5 - 2023/06/02 (金) 03:22:19 - おお フローサイトメトリーで、表面抗原ということはないですよね。ならば透過処理はいらないし。また、膜タンパクならPFAよりPeriodate-lysine-paraformaldehyde (PLP) 固定のほうが確実だと言われているようです。

(無題) 削除/引用 No.11480-4 - 2023/06/01 (木) 14:08:35 - み 安定発現細胞ではなく一過性強制発現細胞でも染色できないのかな？

(無題) 削除/引用 No.11480-3 - 2023/06/01 (木) 13:13:14 - あああ フローサイトメトリーではなんとか検出できるけど、蛍光顕微鏡ではシグナルが弱すぎて検出できないということですかね。

(無題) 削除/引用 No.11480-2 - 2023/06/01 (木) 12:24:04 - Skeptics ウエスタンはともかく、フローサイトメトリーで染まるなら、それをそのまま顕微鏡で観察しては？

FLAG融合タンパク質の免疫染色が染まらないことについて 削除/引用 No.11480-1 - 2023/06/01 (木) 10:07:11 - FLAG お世話になります。 培養細胞にFLAG融合タンパク質を安定発現させ、ウエスタンやフローサイトメトリーでも全細胞でその発現が確認できました。 そこで、蛍光画像の撮像もすべく、培養細胞を４％PFA、10分固定し、0.05% Triton X-100で膜透過処理し、FLAG抗体での染色を試みましたが、全く染まっていないようでした。 抗体を変えたりと何度も試しましたので間違いないと思います。 おそらくFLAGタグがタンパク質の内部に隠れているのではと考えております。 そこで、次に何をすべきかをご助言いただきたいです。 個人的には有機溶媒系の固定液での固定（メタノールやアセトンなど？）はやる価値があるかなと思いますが、第一選択となりますでしょうか？もし他のオプションありましたら、同時に検討したいと思っています。 どうか、ご助言よろしくお願いいたします。

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