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(無題) 削除/引用 No.11486-4 - 2023/06/03 (土) 03:52:03 - おお G25さんに一票。 たまたま大腸菌に都合のわるい配列が入っていた場合、そういうのが変異（デリーションなどふくむ）して都合悪い配列がなくなれば、そっちに置き換わってしまうのはあっという間です。１つのクローン（とか）が増えていくような系では気をつけたほうがいいです。PCRで１コピーの混入が問題になることも多々あるわけですし、培養細胞でもクロスコンタミはわけのわからない結果になることがあります。昔いろいろな細胞が樹立されたにもかかわらずかなりの細胞株がHeLaに置き換わっていたなんていう話もあります。

(無題) 削除/引用 No.11486-3 - 2023/06/02 (金) 18:10:49 - のり G25さん ご回答ありがとうございます。単一クローン性は大切ですね。 この他に、挿入する遺伝子によっては液体培地だと挙動が不安定になるようです。 実験系を含めて再度検討いたします。有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.11486-2 - 2023/06/02 (金) 11:50:23 - G25 それやっちゃうと単一クローンであることがが保証できなくなるから。 プラスミドを保存、継代、増殖、精製している過程で変異を起こしたプラスミド分子が混入しているかもしれない。 全くのコンタミネーションで違うプラスミドが混入しているかもしれない。 混入したプラスミドですっかり置き換わるということはないかもしれない（それだったらすぐ気がつくだろう）。最初はごく微小な画分だったとしても、さらに継代、増殖しているうちに不正なプラスミドの割合が殖えてくるかもしれないし、割合が変化することで再現性が損なわれるかもしれない。 実際にどの程度、危険性があるか、結果に影響があるかはさておき、なにか混じり物がある可能性が排除できない材料で実験をしたいだろうか？ 不正なプラスミドの混入が全くないという証明はできないし、やってる途中で新たに起こる可能性も排除できない。しかし、実験をシングルコロニーから始めることで、可能な限りの配慮を施したということが言えるだろう。

形質転換後の寒天培地による選別の必要性 削除/引用 No.11486-1 - 2023/06/02 (金) 10:39:38 - のり 初歩的なことで恐縮ですが標題に関してご相談させてください。 プラスミドを取り込んだ（形質転換した）細胞を選別するためには、抗生物質を添加した寒天培地を用いてクローニングする方法が指南書に掲載されています。実験室で複数のDNA断片から結合したプラスミドなら、寒天培地によるクローニングの必要性は理解できます。しかし、シークエンス解析で確認済みのプラスミドに対して、再度形質転換して寒天培地により選別する必要性がわかりません。寒天培地の作製は液体培地と比較して工程が多いので、どちらの培地でも選別が可能なのであれば液体培地で対応したいと考えています。 例えば、寒天培地で作製したシングルコロニーは保管が楽、寒天培地のシングルコロニーから液体培地に植菌することで再現性が高まるなど、何か理由があればご教授をお願いいたします。

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