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(無題) 削除/引用 No.1153-5 - 2012/11/16 (金) 12:12:41 - おお > おお様 > 使っている細胞はHEK293Tです。 > T antigenについては勉強不足で分からないのですが、影響がありそうでしょうか？ TantigenはプラスミドのSV40oriを認識して、replicationをそくしんします。なので導入後プラスミドがepisomalに細胞内で増幅されます。2種類のプラスミドをいれると、競合的にどちらかが有利に増えたりしないかなあとうたがったのですが。ただそう思っているだけで違うかもしれません。 HEK243TでなくてHEK243やHeLaを使ってみるとTantigenの影響はなくなるので、やってみるといいかもしれません。 一方を安定導入するか、テット誘導性にするとかもいいかもしれません。ちなみにTantigenの発現する細胞で安定導入するとSV40oriがゲノムに組み込まれるため染色体が不安定になるのでやめた方がいいという話はあります(それでもやっている人はいますけど)。

(無題) 削除/引用 No.1153-4 - 2012/11/16 (金) 11:10:12 - 転写くん ご返答ありがとうございます。 KY様 今回の実験では、蛋白の活性が変化するかを調べたいと思っていますので、蛋白量が変化すると正確な評価ができず、困っております。 3つの可能性の中では、トランスフェクション量を変えるのが一番手っ取り早そうですね。 おお様 使っている細胞はHEK293Tです。 T antigenについては勉強不足で分からないのですが、影響がありそうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1153-3 - 2012/11/16 (金) 01:18:45 - おお 使っている細胞はなんでしょうか?Tantigen入っているか入ってないかで起こっていることが違うかもしれませんので。

(無題) 削除/引用 No.1153-2 - 2012/11/15 (木) 22:32:33 - KY 私も同じような現象を経験します。免疫染色すると、片方が高発現している細胞では、もう一方が低レベルであることがあります。 局在や結合を見るための実験だったので、それぞれの発現量はそれほど問題にはなりませんでした。 それぞれの発現量が重要になるのであれば、 １、違うプロモーターを使用する ２、同じベクターでGFP発現をネガコンにしてみる。 ３、２つ同時に発現させたときと同じ位のレベルになるように、タンパク質Aのトランスフェクション量を減らしてみる。 などが必要になると思います。 ネガコンにタンパク質Bの機能変異体などがあれば、もっといいと思いますが。

2つの蛋白を過剰発現させた時の発現干渉 削除/引用 No.1153-1 - 2012/11/15 (木) 18:28:47 - 転写くん 蛋白Aの効果が蛋白Bを発現させる事によって変化するかを調べようとしています。 pcDNA3にクローニングし、それぞれ一つだけを発現させた時は、両方とも強く発現する事は確認できたのですが、二つ同時に発現させると、一方のみの発現になってしまいます。 この様な現象は、内因性の蛋白に対しては起こらないので、発現プロモーター同士の干渉ではないかと思っているのですが、これは良くある事でしょうか？ また、このような場合は、トランスフェクションするプラスミドの量を調節する事で回避できるものでしょうか？ 経験のある方、どうぞよろしくお願い致します。

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