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(無題) 削除/引用 No.1156-10 - 2012/11/18 (日) 06:49:32 - コマネチ おおさん＞ ありがとうございます。 そうですね、さすがに他のラボにないわけがないので、 それも含めて一度相談をしてみるようにします。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1156-9 - 2012/11/18 (日) 06:48:30 - コマネチ KYさん＞ ありがとうございます。 そうですね、すでにその細胞株が出回っているのであれば そこから入手するべきなのだと思います。 週明けにでも教授に相談をして、 入手が可能かどうか相談してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1156-8 - 2012/11/18 (日) 04:58:35 - おお homologous recombinationを断念したということですが、きっとエレクトロポレーションの機材がそろっていないためかとおもいます。樹立するのに1回やればいいわけで、どこか持っている研究室を探して1ショットやればなんとかなるのではないかともおもえますが。

(無題) 削除/引用 No.1156-7 - 2012/11/18 (日) 03:31:21 - KY トランスジェニックマウスでは、特異的プロモーターとGFPで目的の細胞でのみGFP発現させることがよくありますが、なぜか培養細胞では少ないというか、個人的には見たことないような。 きっと培養細胞では目的のクローンを取る過程で、かなり面倒なんじゃないですかね。 しかも必要なプロモーター部位も不確かなのであれば、自身でプロモーターアッセイして、領域を決めて、安定発現株を作成するのに一年以上はかかるでしょう。しかも同じようなES細胞株がすでに存在するのであれば、それを作成すること自体で、他のラボより有利なツールが手に入る訳でもない。時間的にも金銭的にも、なんとしてでもトラップベクターESなどもらった方が、いいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1156-6 - 2012/11/17 (土) 08:15:36 - おお 特定の転写因子などに着目したような場合、上流の配列をプラスミドにクローニングして、レポーターgeneの前に組み込むことはよくやられます。 完全にナチュラルなレギュレーションを再現したい時にちょっと困るのは、上流何キロベース取ってくればよいかです。プラスミドにクローニングする際に20kbpほどまずは取ってきて、デリーションをかけて影響のある配列などを確かめていくというアプローチはよく見られます。エンハンサー/プロモーターの研究で上流数キロベースで非常によくキャラクタらいずされているもので、さらに上流50kbpsのところにリプレッサーが見つかったという報告も見たことがあります。 そうすると、上流どれくらいの長さ必要なんだろうかというのが悩みどころかと思うのと、これほど長くなるとレンチやレトロでは厳しいかもしれません。 まああるエンハンサー/リプレッサーシスエレメントが含まれてなくてもあなたの注目する現象において、実際の転写のレギュレーションが反映されていればいいので上流思いっきり長くしなければならないかというと、そうとも限りませんけど。 ついでに言うとプロモーターの下流にエンハンサーやリプレッサーが見つかったりすることもあります。 もう一つの心配はGFPです。GFPは細胞ないの半減期が長く安定なため、プロモーターのタイムリーな活性変化を反映しにくくなっています。確か昔これを解消した半減期が短いGFPがストラタジーンから売られていましたが(今アジレントになってますが)最近フォローしていないのでどうなっているのか分かりません。リポーターとして何がベストかは最近この手の仕事をしていませんのでちょっと私の中では答えにくいですが、どなたか経験のある方のコメントがつくと良いですね。

(無題) 削除/引用 No.1156-5 - 2012/11/17 (土) 06:28:19 - コマネチ Harmoniaさん＞ ありがとうございます。 国内では、トップレベルのラボが持っているそうですが、 分野としては競合しているため、なかなか譲ってはもらえなさそうです。 ヨーロッパのラボで提供している可能性がありますが、 ボスの性格上わざわざ海外から、 ということはしたがらないため、自作で以降かと思った次第ですが、 経済的にも厳しいラボなため、 使える手が少なく四苦八苦しているところです。 もう少し探すようにしてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1156-4 - 2012/11/17 (土) 06:24:37 - コマネチ おおさん＞ ありがとうございます。 そうですね。コピー数のばらつきもあると思いますし、 クローンごとの解析も必要になるので ある意味煩雑な作業になるかもしれませんが、 理論上はあり得るということですね。 トラップベクターに関しては知りませんでした。 目的のものはデータベース上にはみつかりませんでしたが、 非常に勉強になりました。 ありがとうございます。 homologous recombinationに関しては お恥ずかしながら当研究室に機材がなかったためとりあえず first choiceとして除外していました。 他のラボで借りれるかも確認したいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1156-3 - 2012/11/16 (金) 20:12:39 - Harmonia できないことは無いでしょうが、おおさんの仰るのと同様、ぼくなら、 まずはその様な細胞がないか、文献なり細胞バンクやマウスバンクの カタログを調べます。

(無題) 削除/引用 No.1156-2 - 2012/11/16 (金) 15:53:46 - おお 方法論としてあり得ますが、得られた細胞で検証してみないとだめでしょうね。必ずしも、また得られた全部のクローンがのぞみどおりの発現をするわけではありませんから。 ESを使っているのでしたら、homologous recombinationで染色体上のそのプロモーターの下流にGFPをほりこむとより直接的かとおもいます。一応へテロでもう一方のアレルからそのタンパク(mRNA)が発現するなら、大きくバランスをくずさないで、正常に近い形で見れるのぞみがありますから。 また、一時トラップベクターというのが流行って、それを入れたESがいろいろ作られていて、そのコレクションをもっていて売っているところがあるかもしれません(マウスの話です)。 トラップベクターはごじしんで調べてみてください

プロモーター置換による部位特異的遺伝子発現について 削除/引用 No.1156-1 - 2012/11/16 (金) 12:52:48 - コマネチ お世話になっています。 不確かなので教えていただきたいのでよろしくお願いいたします。 ES細胞が特定の細胞に分化した際にGFPが発現するよう 遺伝子改変を行いたいのですが、 単純にGFPベクターのプロモーター（CMVプロモーター等）を 目的の遺伝子のプロモーターに置き換えればそれは可能なのでしょうか。 つまり、GFPベクターのプロモーター部位を制限酵素で切断し、 PCR等で増幅させた目的の遺伝子のプロモーターを 貼り付けるだけでとりあえずＯＫで、 これで作成したウイルスベクターをES細胞等に遺伝子導入することで 理論上は可能ということでしょうか。 稚拙な質問かもしれませんが、まわり聞ける研究者がおらず、 本を読んでも不確かなため教えていただければ幸いです。 どうぞよろしくお願いいたします。

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