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(無題) 削除/引用 No.11599-21 - 2023/07/18 (火) 13:27:14 - せっかち 研究室に55℃あたりに設定された乾燥機があれば、電気泳動用のアガロースゲルを融かしたままでキープできます。必要なだけ使って密栓してまた乾燥機に戻せばよいので楽ちん。

(無題) 削除/引用 No.11599-20 - 2023/07/18 (火) 10:03:58 - おお DNAをいじくるような酵素は昔は処理した後はフェノール、クロロフォルム処理で不活化、除去してから次の処理にうつるのが基本的でした。 だんだん熱変性で反応をストップしたり、次の反応に影響ないような処理ならばそのまま次のステップに行ったりとずいぶん融通を効かせて簡略化をしていることが多いですね。 で話題が変わりますが、ウエスタンでニトロセルロースを２枚重ねてトランスファーするとTransferをDuplicateできるってのがありましたね。大昔にあるメーカーが五枚（だったかな）重ねても最後のメンブレンでアクチンとか検出できるとか言って売り込みに来てたのを思い出しました。なんだか、おいおいって感じですが、、、そのとき定量性はどうなのと聞いたかもしれませんが、あんまり覚えてないですね、、、

(無題) 削除/引用 No.11599-19 - 2023/07/17 (月) 07:26:22 - Tombo T4 PNK でPCR産物やオリゴペアをリン酸化後、自己環化や制限酵素で切ったベクターとライゲーションする場合、65CでのPNKの熱不活性化や精製は必要なし。 リン酸化（20分）後、反応物を水かTrisバッファーで薄めて、そのままライゲーションに持っていく。

(無題) 削除/引用 No.11599-18 - 2023/07/17 (月) 03:00:05 - 　67y8u9 Western blottingの際のメンブレンの洗浄は（抗体が問題ないものならば）５分３回と10分３回で差はない。BGが高いなら、それはもともと抗体自体の問題で、洗いを長くしても多少はよくなるかもしれないけど根本解決にはならない。

(無題) 削除/引用 No.11599-17 - 2023/07/16 (日) 20:54:24 - あの 水でリンスするとか、すすいでから、洗いに入るって意味ですか？

(無題) 削除/引用 No.11599-16 - 2023/07/15 (土) 03:23:58 - おお >[Re:15] うえすたんさんは書きました : > ウエスタンブロッティングのTBS-T washは、超純水で洗ったあとに行うとかなり短時間で済む。 なんか都市伝説級。 サイドバイサイドでやった結果をどこかに挙げてほしいくらい。。。てか水で洗ってたテクニシャンがいたな、、、

(無題) 削除/引用 No.11599-15 - 2023/07/14 (金) 19:14:50 - うえすたん ウエスタンブロッティングのTBS-T washは、超純水で洗ったあとに行うとかなり短時間で済む。

(無題) 削除/引用 No.11599-14 - 2023/07/14 (金) 11:04:16 - G25 >モレキュラークローニングの初版には冷やすのはあまり意味がないと書かれています。微量でも回収できると書かれていましたよ、たしか。冷やさないにしても少し静置したほうが壁につきにくいと聞いたことがありますが、本当のところはよくわかりません。 BRL（のちのinvtrogen)のカタログのappendixには早くからフリーザーなどで冷却するのは効果がないどころか回収率を下げるということが書いてありました。その根拠はBRLが出していたmethodologyの雑誌「Focus」の記事です。 おそらく冷却することで粘性が上がり沈殿速度を遅くするからだろうということです。 探したらネット上に残っていました。 https://intra.pasteur.uy/publico/bonilla/Protocolos/Precipitado/Focus%20Volume%207%20Issue%204.PDF Molecular Cloningではfreezerなんかで冷やすのはunnescessoryとは書かれていますが、かえって回収率を悪くするとまでは踏み込んでいなかったと記憶します。20 ng/mL以上の濃度があれば普通にEtOH pptすればいいとも。 濃度が非常に低いとかDNAサイズが100 nt以下など小さい場合は、CarrierやMg++を添加したり、遠心時間を伸ばすようにとありますが「冷やせ」とは書いていません。 >冷やさないにしても少し静置したほうが壁につきにくいと聞いたことがありますが、 これ目に見えるくらい大量のDNAをpptするとわかりますが、しばらく直立で静置すると重力で沈殿が底の方に溜まってくるので、遠心しても底の方にコンパクトに沈殿がまとまります。EtOHをミックスしてすぐに遠心すると、液中に漂っているDNAがそのまま遠心端側の壁に押し付けられるので、広い範囲にスメアになります。

(無題) 削除/引用 No.11599-13 - 2023/07/14 (金) 10:51:08 - ◯ プライマーやターゲットによるとは思いますが。 ExTaqを使って 98°C 1秒 60°C 1秒 （0秒の設定が出来なかったので1秒です） で0.5 kb程度なら問題なく増幅しました。 ゲノムの簡易抽出5分、ミニゲルの泳動を200V 10分、と組み合わせて35分ほどで結果確認。 実験の都合上迅速診断が必要でしたのでいろいろ試した結果行き着きました。 ランプタイムの間に十分伸長しているのだと思います。 、高速PCR用のサーマルサイクラーだとうまく行かないかもしれません。 KOD OneとかKapaとかだと高速PCR用でもいけるのかも。

(無題) 削除/引用 No.11599-12 - 2023/07/14 (金) 10:23:10 - AA 私もなぜかKODと相性が悪く、増えなかったり謎のエラーが入ったりしてました。 身近な知り合いにはKOD愛好家も多く、信頼できる実験をしているので製品としては良いものであることは疑いないのですが、何故か私の経験上はだめでした。 最近のわたしのお気に入りの高正確性酵素はTakaraのTks Gflexです。高速で高正確かつ増えにくい配列も増やせるので重宝してます。 同じような感じで、NEBのEngenのCas9は何故かうまく実験ができません。同じNEBでも古くから売っている方のNLSがないやつのほうが目的の改変が得られやすいです。これもEnGenでうまくいっている人のほうが身の回りで多数派なので製品自体に問題があるとは考えにくく、もはやおまじないレベルなのですが自分は相変わらず古い製品を買い続けています。

(無題) 削除/引用 No.11599-11 - 2023/07/14 (金) 09:43:08 - toto 11599-6でおおさんのかかれた分離ゲルにグリセロールを入れるという話ですが、確かにgradientゲルを作るときにもそうするわけですが、ただ、グリセロールはなぜか分離をやや悪くするという話が、Methods Enzymolのどこかに書いてありました。それで推奨されてたのは代わりにショ糖をいれるということでした。全く理由はわかりませんが、確かに、そういう傾向は感じました。

(無題) 削除/引用 No.11599-10 - 2023/07/13 (木) 23:14:19 - K KOD Oneを使っていましたが、正確性ではPrime star maxと比べていかがですか？ なぜだか、KOD Oneとは相性が私は悪いようで、ゲノム1kbのクローニングで20サイクルPCRしてバシッと一本出ますが、ベクターにクローニング後に7つのクローンを読んで一つのみ配列が当たりのものでした。 Uvは数秒しか当ててませんしサイクル数を減らしてもかなり点変異がランダムに入ります。 おすすめの酵素、特に正確性で信頼のある酵素をお勧めしてくださいm(__)m

(無題) 削除/引用 No.11599-9 - 2023/07/13 (木) 09:13:41 - うーん 補足しますね。 KOD one だと、PCR フラグメントが 1kb 以下なら extension は1秒です。 1-5kb ならキロベース分の秒（2kbなら２秒）です。 熱変性、アニーリングもめちゃ短いです。 タイムイズマネーだし、たいして割高ではありません。 また、KOD plus neo のことに触れられている方もいらっしゃいますが、one の方が早いです。（被せちゃってすみません。） ですので、ごく普通の PCR ならメシ食ってる間に終わると書いた次第です。 はじめは信じられませんでしたが優秀で、ばしっと増えます。

(無題) 削除/引用 No.11599-8 - 2023/07/13 (木) 08:48:45 - おお >[Re:7] せっかちさんは書きました : > ゲルに流して見えるくらいの濃度があるDNA溶液なら、エタノール沈殿は冷やしたりしないですぐに遠心してもロスしない。 モレキュラークローニングの初版には冷やすのはあまり意味がないと書かれています。微量でも回収できると書かれていましたよ、たしか。冷やさないにしても少し静置したほうが壁につきにくいと聞いたことがありますが、本当のところはよくわかりません。

(無題) 削除/引用 No.11599-7 - 2023/07/13 (木) 08:10:09 - せっかち ゲルに流して見えるくらいの濃度があるDNA溶液なら、エタノール沈殿は冷やしたりしないですぐに遠心してもロスしない。

(無題) 削除/引用 No.11599-6 - 2023/07/13 (木) 00:17:37 - おお SDSPAGEのゲルを作る時分離ゲルにグリセロールを入れとくと、分離ゲルが固まるのを待つ手間が省けて、分離ゲル入れたあとすぐに濃縮ゲルMixを重層してコーム入れて固まるのを待てばいい。

(無題) 削除/引用 No.11599-5 - 2023/07/12 (水) 18:07:58 - egeria SDS-PAGEのゲルを作製するとき、多くの人はpH 8.8 (separation) と6.8 (stacking) の2種類のバッファーを使っていますが、実はこれはほとんど意味がありません。stackingゲルをseparationゲルと同じバッファーで作ってもほぼ同じ結果になります（300 kDaくらいの大きなタンパク質の分離は影響を受けると言われている）。 一般に言われている不連続pHによるスタッキングは、Native PAGEの説明としては正しいのですが、SDS-PAGEの説明としては間違っているようです（SDS自身によってスタッキングが起きる）。 ゲルにSDSを入れるのも意味がありません。泳動バッファーから供給されます。

(無題) 削除/引用 No.11599-4 - 2023/07/12 (水) 15:53:39 - YK ExtensionはKOD -plus- neoとかの最近の試薬だと30sec/kbになってたりする あとIn fusionは収量は減るけどプロトコルの半量でも行けたり。。。 生化学実験か微妙だけど経験上では大腸菌のトラフォメは, 氷上20min→plasmid液混合→1min程度氷上→LBプレート(incubatorで30min〜1hr静置したもの)塗布 で生えるし、タンパク発現も条件によるけど温めたLB培地に10コロニー入れて3hrくらい振ればpreculture代わりになったりする

(無題) 削除/引用 No.11599-3 - 2023/07/12 (水) 12:02:00 - ぽいう 生化学実験のほとんどは、多め、長めに設定されているので、加える量と反応時間は0.7xで足るらしい。 なんなら0.5xでも良い。自己責任でお願いします。

(無題) 削除/引用 No.11599-2 - 2023/07/10 (月) 19:23:29 - うーん KOD one を使えばメシ食ってる間に PCR 終わります（30-40分）。

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