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サザンハイブリダイゼーションにおける特異性について トピック削除
No.116-TOPIC - 2012/02/03 (金) 18:47:12 - みるぽ
はじめまして。私は現在サザンを使用したDNA配列の特異性の確認を行っています。プローブは5'側にDIG標識を施したもので配列は(TTAGGG)7および(TTAGG)7の二種類を使用しています。しかしながらTTAGGG配列の特異性を確認しようとしたところ、TTAGG配列のプローブでもシグナルが検出されてしまいます。このような場合、原因としてはどのようなことが考えられるでしょうか？私もいろいろ試してはいるのですが、皆さんの意見をお聞きしたく書き込みをいたしました。どうかよろしくお願いします。

検出手順は以下の通りです。

１．制限酵素RsaTを用いてDNAを消化後、アガロースゲルにて電気泳動。
２．通常のサザンブロットを行い、メンブレン上にDNAをUV固定。
３．DIG Easy Hybを65℃に温めメンブレンをプレハイブリ。
４．10pmolプローブを100℃5分で熱変性させ、65℃のハイブリ液7mlに対し7μlで12時間ハイブリダイズ。

５．洗浄液（マレイン酸＋TWEEN20）で3分洗浄。
６．DIG Nucleic acid detection kitのブロッキング液で30分ブロッキング。

７．抗体液を用いて30分浸漬後、洗浄液で室温で15分×2回洗浄。
８． NBT/BCIPを用いて暗所で静置させ発色。
　
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(無題) 削除/引用
No.116-6 - 2012/02/06 (月) 12:12:54 - みるぽ
皆さん貴重なご意見ありがとうございます。
やはり今の配列で完璧に特異性を示すことは難しいのですね。
残念ながら現在RIは使用できませんので他の方法で頑張ってみます。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.116-5 - 2012/02/06 (月) 08:50:55 - ~
RIは使えないのでしょうか？
DIGだとどこで反応をとめるかの見切りが難しいですが、RIだとカウントを見ながら洗浄できます。

Competitive Hybridization 削除/引用
No.116-4 - 2012/02/03 (金) 22:47:44 - CH
I. ターゲット配列(TTAGGG)n対して、
1. 標識した(TTAGGG)7と、大過剰の無標識(TTAGG)7を競合的にハイブリさせる。
2. 逆に、標識した(TTAGG)7と、大過剰の無標識(TTAGGG)7を競合的にハイブリさせる。

II. ターゲット配列(TTAGG)n対して、
1. 標識した(TTAGGG)7と、大過剰の無標識(TTAGG)7を競合的にハイブリさせる。
2. 逆に、標識した(TTAGG)7と、大過剰の無標識(TTAGGG)7を競合的にハイブリさせる。

うまい条件（温度、塩濃度）が見つかれば、I-1とII-2でシグナルが検出される。

(無題) 削除/引用
No.116-3 - 2012/02/03 (金) 22:18:10 - AP
(TTAGGG)nの標的配列に対して、(TTAGGG)7と(TTAGG)7のプローブでハイブリの仕方に区別がつくか、ということですね。数塩基くらいのミスマッチやギャップくらいで、きれいにハイブリしなくなるというものではないので難しんじゃないでしょうか。
ハイブリ後の洗浄のストリンジェンシーの絶妙なコントロールが必要なのではないでしょうか。洗浄温度を高い方に振るとか塩濃度を低い方に振るとか、相当な条件検討をする必要があるでしょう。

(無題) 削除/引用
No.116-2 - 2012/02/03 (金) 20:34:22 - も
1.ターゲットＤＮＡが濃すぎる＊＊
4.プローブが濃すぎる＊＊
5.洗浄条件が不十分、温度、塩強度＊＊＊
6.ブロッキング画布十分＊
7.抗体が濃すぎる＊＊
7’洗浄が不十分＊

くらいでしょうか

サザンハイブリダイゼーションにおける特異性について 削除/引用
No.116-1 - 2012/02/03 (金) 18:47:12 - みるぽ
はじめまして。私は現在サザンを使用したDNA配列の特異性の確認を行っています。プローブは5'側にDIG標識を施したもので配列は(TTAGGG)7および(TTAGG)7の二種類を使用しています。しかしながらTTAGGG配列の特異性を確認しようとしたところ、TTAGG配列のプローブでもシグナルが検出されてしまいます。このような場合、原因としてはどのようなことが考えられるでしょうか？私もいろいろ試してはいるのですが、皆さんの意見をお聞きしたく書き込みをいたしました。どうかよろしくお願いします。

検出手順は以下の通りです。

１．制限酵素RsaTを用いてDNAを消化後、アガロースゲルにて電気泳動。
２．通常のサザンブロットを行い、メンブレン上にDNAをUV固定。
３．DIG Easy Hybを65℃に温めメンブレンをプレハイブリ。
４．10pmolプローブを100℃5分で熱変性させ、65℃のハイブリ液7mlに対し7μlで12時間ハイブリダイズ。

５．洗浄液（マレイン酸＋TWEEN20）で3分洗浄。
６．DIG Nucleic acid detection kitのブロッキング液で30分ブロッキング。

７．抗体液を用いて30分浸漬後、洗浄液で室温で15分×2回洗浄。
８． NBT/BCIPを用いて暗所で静置させ発色。
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