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バックグラウンドが高い画像の２値化方法 トピック削除
No.11624-TOPIC - 2023/07/19 (水) 09:39:01 - 理系女子大生
imageJを使用して画像処理をしたいと考えております。
しかし、バックグラウンドが高く、上手く２値化することができません。

バックグラウンドがない画像を取得するには、かなりスペックの高い顕微鏡で撮影する必要があるのでしょうか。
　
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No.11624-8 - 2023/07/21 (金) 14:40:41 - 理系女子大生
下の論文の方法も試しましたが、樹状突起の断片を上手く取り除くことができませんでした。

(無題) 削除/引用
No.11624-7 - 2023/07/20 (木) 16:30:04 - qq
こんなのがあります。
Young, K., Morrison, H. Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ. J. Vis. Exp. (136), e57648, doi:10.3791/57648 (2018).

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No.11624-6 - 2023/07/20 (木) 16:01:26 - B
顕微鏡のスペックとは関係ないと思います。

DAB発色の酵素抗体法ということですので、検出はHRP系ですね。脳組織はもともとoxidase 活性（たぶんモノアミンオキシダーゼかなあとおもう。）が高いのでHRP/DABの発色系だとバックが上がりやすいです。H2O2で内在性ペルオキシダーゼ活性の失活処理はしてるとおもいますが、どのようにされてますか。通常0.3%H2O2 in メタノールで20~30分でたいていは問題なくいけるのですが、脳の場合はもしかすると不十分かもしれません。時間のばすか、3%H2O2、5分とかもためしてもいいかもしれません。

酵素抗体法をやめて、２次抗体を蛍光抗体に変えて蛍光抗体法でやってみるのも一つの手です。酵素法と比べると感度的には多少落ちますが、バックグラウンドの問題はクリアできると思うので問題解決につながるように思います。うまくいけばS/Nもクリアですし、2値化しやすく定量も楽です。

(無題) 削除/引用
No.11624-5 - 2023/07/20 (木) 15:40:19 - 理系女子大生
ミクログリアのDAB染色像になります。
ミクログリアのような細い樹状突起をもつ細胞の２値化をしたいのですが、バックグラウンドが高いため、なかなかうまくいきません。

(無題) 削除/引用
No.11624-4 - 2023/07/19 (水) 11:14:08 - おお
もともとのS/N比が低いのであれば顕微鏡の問題ではないような気がしますが、、、

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No.11624-3 - 2023/07/19 (水) 11:11:43 - B
Image J でしたらバックグラウンド減算（background subtraction)という操作が使えると思います。この言葉で調べれば手順はWebや画像解析の書籍でも出てると思いますのでたぶんそれでいけるのではと。

(無題) 削除/引用
No.11624-2 - 2023/07/19 (水) 10:59:27 - てってってー
情報が少ないので正確な回答は難しいです
高い顕微鏡というより適切な顕微鏡を使わなければ適切な画像が撮れないことはあります。
ただ、スペックが同じで値段が違う顕微鏡があったら値段の違いだけでバッググラウンドの高さが決まることはほぼないでしょう。値段が高い顕微鏡が何を指してるのかはわかりませんが。
例えば免疫染色であれば抗体が悪い、染色条件が悪い、そもそもターゲット分子が少ない、ということの方が懸念すべきです
あとは蛍光画像であるのであればフィルターが合っているかどうかは確認した方が良いでしょうし、波長とサンプルによっては自家蛍光が高いものもあるでしょうから、その場合みたいものを別の方法で検出することも視野に入れた方がいいこともあります。
細胞を染色なく数を数えたい、といった場合には位相差顕微鏡などを使用することになるでしょうが、その場合問題になるのはバックの高さよりも細胞密度や不純物でしょう

なんにしても、どんなサンプルを、どんなものを使用して、どんな条件で見たいのかがわからなければ正確な回答はできません

バックグラウンドが高い画像の２値化方法 削除/引用
No.11624-1 - 2023/07/19 (水) 09:39:01 - 理系女子大生
imageJを使用して画像処理をしたいと考えております。
しかし、バックグラウンドが高く、上手く２値化することができません。

バックグラウンドがない画像を取得するには、かなりスペックの高い顕微鏡で撮影する必要があるのでしょうか。
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