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(無題) 削除/引用 No.11625-5 - 2023/08/07 (月) 20:43:25 - Arr アイディアをありがとうございます。 一旦、新鮮凍結でやってみることにしました。 固定しなければ、賦活化もしなくていいのではないかなと思い… それで上手くいかなければ、RFPと賦活化を用いた方法でやってみます！

(無題) 削除/引用 No.11625-4 - 2023/07/20 (木) 11:25:12 - G25 GFPやdsRes(RFP)などの蛍光タンパク質が容易に変性して光らなくなるというのは昔からよく知られていると思います。標本の処理中にアルコールやアセトンなどの有機溶媒に接触するのは厳禁、カバーグラスの周囲を封じたアニュキュアに含まれるアセトンが標本に拡散しても退色するなんて言われてました。 有機溶媒どっぷりのパラフィン切片では光るべくもない。 賦活化なんて要はタンパク質を変性させて本来暴露していないエピトープを表に出す操作なんだから、光らなくなって当然。 とすれば抗体で検出するのが一番だけど、お使いの抗体は変性タンパク質には反応しないようで。ストレートな解決策はそれでも反応する抗体を探すことでしょうか。 うまくいく保証はないけどアイデアとしては、 凍結切片（賦活化処理なし）に抗RFP抗体を反応 ↓ post-fix ↓ 賦活化 ↓ 抗標的タンパク質抗体 ↓ それぞれに対する二次抗体で検出 てのはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11625-3 - 2023/07/20 (木) 10:32:57 - おお リコンビナントを抗原にしたポリクロなら何とかなりそうな気もするが、

(無題) 削除/引用 No.11625-2 - 2023/07/20 (木) 10:05:35 - AA 蛍光タンパク質ですので変性してしまう条件下で蛍光が失われることは避けられません。したがって何らかの別の手段で標識するしか無いです。 個人的にはやはりRFP抗体で検出するしか無いのではないかと思います。 RFP抗体はGFPのように質の良いものに出会えない印象が強いですが、最近も継続して新しいものが出ていますので色々試すことをおすすめします。アルパカのやつとかいいとか風のうわさで聞きました。

Tdtomatoを賦活化条件下で染める方法 削除/引用 No.11625-1 - 2023/07/19 (水) 11:50:18 - Arr 私は今、Cre loxpシステムを用いてTomatoをノックインしたマウス大腸の細胞のリネージトレーシングを行っています。 そこで、組み換えマウスがしっかりワークしているかどうかを蛋白とTomatoが重なるかどうかで見たいと考えています。 今までの様々な条件検討の結果、凍結切片が最もよくTomatoが見えています。パラフィンだとRFP抗体を用いてもシグナルを確認出来ませんでした。また、凍結切片で賦活化をした時は、Tomatoが見えなくなりました。一方、同時に染めようとしている蛋白は、DABでもチラミド染色でも賦活化をしないと見えないものです。 そこで質問なのですが、Tomatoがパラフィンや賦活化条件下で見えなくなってしまうのは何故でしょうか。また、この場合、蛋白とTomatoを同時に見る方法は何かありますか？ 色々調べてみたのですが、分からず…ご教授いただけると幸いです。

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