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(無題) 削除/引用 No.11640-6 - 2023/07/22 (土) 02:21:08 - おお pratial digestionは選択肢だと私も思います。ちょっと気がかりなのは末端と内部どちらが切れやすいかという点。PCRフラグメントなら特に。よくMCSで使われるような酵素で多少の足場があれば切れるような酵素だったら大丈夫かもしれない。 ３ピースライゲーションというのもあるんだけど、お示しのようなケースでそのままやれば短いものしか取れないけど両端で違う酵素を使っているなら、両端が違う酵素で切れている奴をフォスファターゼ処理する。ベクターはPCRフラグメントを２箇所切る酵素できってフォスファターゼ処理してからもう一方をの酵素できる。と細工を施してから３ピースライゲーションとかやればなんとかなる。ただ同じ酵素で切れている断片は反対方向に入るクローンも出てくるので、ある程度のポジのクローンをミニプレップして確認するか、コロニーPCRのときスクリーニングできるように工夫するかという流れになるとおもう。 もう一つのやり方の可能性として、PCR産物を２箇所きる酵素は使わずそちらの末端は平滑のまま挿入する。この場合フレームが合わなる心配がないときなどに限られます（ただしある程度工夫することで何とかなる場合もありますので以下に書きます）。 違う平滑末端の酵素が使えればそれでもいいし、ないならベクターをPCR産物を２箇所きる酵素で切って平滑末端処理をしてからもう一方の酵素で切る。この場合必ずしもベクターをPCR産物を２箇所きる酵素で切らないといけないわけでもなく、フレームが合う必要があるなら、切って平滑末端処理をしてつないだ時にフレームが合いそうな酵素を探すという事も考えられます。 むかし、制限酵素の切断末端に合うようなオリゴをPCR産物に付加してLigationするという方法がありました。 http://exerciseforthereader.org/nebmbp/day6pm.html こちらの下にあるような奴。ライブラリーみたいなのでなければ２本鎖になっている部分はそんなに長くないやつも使われていたと思います。PCR産物につけるなら、３ピースライゲーションの要領でも構わないと思います。とーい昔タカラとか各種制限酵素に対応したものを商品として売ってたと思うんだけど、、、

(無題) 削除/引用 No.11640-5 - 2023/07/21 (金) 21:19:27 - Skeptic 新しいオリゴ合成などのコストをかけたくなければ次のような方法は？ 制限酵素サイトをAとBとすると、A---A---Bというinsertだということですよね。右側のA---Bという断片をまずベクターにクローニングする。できたプラスミドを制限酵素Aでone cutして、そこにA---A断片をクローニングする。A---A断片が正方向と逆方向のクローンが取れるでしょうが、チェックは容易でしょう。

(無題) 削除/引用 No.11640-4 - 2023/07/21 (金) 21:15:24 - Skeptic Gibson AssemblyやIn-Fusionなどのシームレスクローニンを使っては？

(無題) 削除/引用 No.11640-3 - 2023/07/21 (金) 20:51:32 - のなめ partial digestionは結構成功しますよ。 やってみてあたりが引けなかったら、一度Tベクターに入れて、 Inverse PCRで制限酵素サイトをつぶすとか。 でも長鎖オリゴの値段もべらぼうに高いわけではないし（長さによりますが）、素直に再合成したほうが確実かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11640-2 - 2023/07/21 (金) 20:21:44 - 774R 同じような状況でpatial digestionは何度かやったことありますが、いずれも成功しています。 2個目の酵素消化は時間ではなく、酵素の希釈系列で調整すると良いです。 電気泳動し、部分消化が起こってそうな条件のバンドを回収して用います。 ただ、私の場合はPCR産物ではなくプラスミドからの切断だったので、２つのサイトの切れやすさに差が無かったと思われますが、内部配列とプライマーに付加した末端の配列では、もしかすると差がある可能性があり、内部先に切れるけど、プライマー部分のは切れずらかったりすると難易度が上がるかもしれません。

内部に制限酵素配列がある遺伝子をクローニング 削除/引用 No.11640-1 - 2023/07/21 (金) 19:55:44 - kit 長鎖遺伝子のオリゴ配列を外注で委託しましたが、その際にコドン最適化を行いまいした。 うっかりミスで、片方の末端の制限酵素サイトが内部にも一カ所生じていることがあとから、分かり絶望しています。 制限酵素処理を2段階にして、一段階目は切断箇所が1カ所しかない制限酵素で、長時間の処理。二段階目は二カ所切断サイトのある制限酵素で、軽く処理することで全長をプラスミドにクローニングできないか、模索しているのですが、 不可能でしょうか？

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