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(無題) 削除/引用 No.11641-15 - 2023/07/25 (火) 01:50:55 - おお そのほかタンパク安定性という観点なのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11641-14 - 2023/07/25 (火) 01:49:49 - おお 予想でしかないのですが、核にLuciferaseは発現しない（というか核移行を積極的にしない、特に初期のルシフェラーゼはエンドソームに発現するんだっけ？）ので核を安定化した状態で抽出するという事ではないかと思いますが。 核がある程度可溶化するとねんちょうになって扱いにくくなると思いますので。

(無題) 削除/引用 No.11641-13 - 2023/07/24 (月) 18:39:13 - あの どうして、グリセリン入っているか、ご存知の方いますか？

(無題) 削除/引用 No.11641-12 - 2023/07/24 (月) 15:21:24 - あ そもそも、triton x100では細胞は完全溶解しないので、プレートから剥がれたとしてもペレットとして残ってしまうと思います。 標準化用のタンパク質の値がサンプル間で揃っていればいいんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.11641-11 - 2023/07/24 (月) 14:31:54 - おお >[Re:9] AAAさんは書きました : > ありがとうございます。 > > 今までピペッティングで細胞を剥がすパターンでやっていて、アグった細胞塊が残っているのと、界面活性で泡立ってしまうのが気になっているので、それ以外の方法で試してみたいと思います。 デブリと言うか、不溶性のものが残るのごく自然です。TRITONX100で溶解できない成分がありますので。でもそれは溶解すつ必要がないからで無視できると思います。TRITONX100が1%も入っているなら膜成分は破壊されて、水溶性の内容物は出ていそうですが(顕微鏡で何か見えていても)、予備実験で確認するといいかもしれません。 > 予備実験として、 > １．バッファを入れて凍結融解、 > ２，バッファを入れて超音波5秒＋静置 > ３．バッファを入れてそのまま静置（あまり溶解できないネガコン） > の3パターンで比較してみようと思います。 >

(無題) 削除/引用 No.11641-9 - 2023/07/24 (月) 09:34:45 - AAA ありがとうございます。 INCのLuc assay用の細胞溶解バッファはすでに製造中止になっていますが、SDSを確認したら、組成が公開されていたので、自作で代用できそうです。 成分名 重量% トリトン X-100 1.0 ｴﾁﾚﾝｼﾞｱﾐﾝ四酢酸(EDTA) 0.06 グリセリン 10.0 生理食塩水 <88.9 今までピペッティングで細胞を剥がすパターンでやっていて、アグった細胞塊が残っているのと、界面活性で泡立ってしまうのが気になっているので、それ以外の方法で試してみたいと思います。 予備実験として、 １．バッファを入れて凍結融解、 ２，バッファを入れて超音波5秒＋静置 ３．バッファを入れてそのまま静置（あまり溶解できないネガコン） の3パターンで比較してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.11641-8 - 2023/07/24 (月) 06:30:44 - おお その商品は知りませんけルシフェラーぜアッセイが使われるようになった当時は文献などでも成分明記がされていたと思う。初期はたぶんデタージェントフリーで凍結融解で細胞膜を壊すのを促進していたりするプロトコートだったように思う。プロメガはキットでたぶんTritonX-100を使ったバッファーをキットで提供していたとおもう。 RIPAはちょっと強すぎるかもしれない。 https://med.emory.edu/departments/pharmacology-chemical-biology/murphy-lab/docs-images/lucassay.pdf もしかしたら低張のバッファーで細胞を破裂させるような感じかもっしれない。それならPBSの持ち込もうで効果が下がっているかも知れない。そんな感じなら一度そのバッファーを加えた状態で凍結してしまえば、いいかなとも思う。あるいはスクレイパーとかでゴシゴシするか。この場合デブリを吸い上げる可能性が出てくるかもだけど、それならチューブに移しスピンダウンする方がいいかも(核とかまで溶解しないようなバッファーを使っていると思うので。

(無題) 削除/引用 No.11641-7 - 2023/07/23 (日) 19:13:53 - あの モノレイヤーの細胞相手だから、パワーにもよるでしょうけど、5秒ぐらいで良いのでは。 ちなみに、タンパクの変性が心配なら、短時間ですぐに、オンアイスにて冷やす。

(無題) 削除/引用 No.11641-6 - 2023/07/23 (日) 18:58:24 - AAA ありがとうございます。超音波はいいかもしれません。 超音波は何秒くらい当てる感じでしょうか？あんまりやりすぎると、タンパク質までバラバラになりそうですね

(無題) 削除/引用 No.11641-5 - 2023/07/23 (日) 15:07:08 - あの キットが推奨するもの以外はリスクあるし、大して違わないと思います。 このあたりは、メーカーのサポートにメールした方が良いです。 プレートごと、速度を適度に調整した、ボルテックスの上におくとか、 プレートごと水に浮くなら超音波かけるとかという手もあります。

(無題) 削除/引用 No.11641-4 - 2023/07/23 (日) 13:57:16 - AAA ありがとうございます。やはりかきとる工程が必要ですかね。 今使っているのは、以前、JNC社のルシフェラーゼアッセイバッファを購入した際に、付属していたCell Lysis Bufferを使用しています。組成が分からないのですが、製品として販売されている、RIPAバッファを使用したら、溶け方が変化したりするでしょうか？ あと、Cell Lysis Bufferを加えた状態で凍結、融解したら、細胞膜を壊せるのではないかとも思ったのですがいかがでしょう？、

(無題) 削除/引用 No.11641-3 - 2023/07/23 (日) 12:32:44 - あの 120ではなくて、　150ですね

(無題) 削除/引用 No.11641-2 - 2023/07/23 (日) 12:26:40 - あの レスがつかないようなので、 同等商品を使ったことはありませんが、おそらく何らかの界面活性剤が有効成分だと思います。 その場合、何らかのツールで細胞をかき取る必要があると思います。 当方では、ピペット用のチップを使い、 タテタテタテタテ、、、ヨコヨコヨコ、、、のの字のような感じでかき取ります。 かくついでに　ピペッティングもします。 それからウェルの底が確実に、カバーするぐらいの液量が必要です。 48ウェルで120ul だと、ちょっと少ないかもしれません。

Cell Lysis Bufferで細胞をきれいに溶解させるには？ 削除/引用 No.11641-1 - 2023/07/22 (土) 18:03:03 - AAA いつも勉強させてもらっています。 Cell Lysis Bufferで細胞をきれいに溶解させる方法について質問です。 ルシフェラーゼアッセイの際に細胞内のルシフェラーゼと標準化用のタンパク質溶出のためにJNC社のCell Lysis Bufferで細胞を溶解させています。 溶解前は48well プレートに細胞はコンフルエンスの状態で PBS wash を2回した後、Cell Lysis Buffer　150μLで溶解しています。 室温で、10分間反応させています。 ラボシェイカーがないため、用手的にこまめに回しながら反応させています。 10分後に顕微鏡の位相差像で観察すると、まだ大量に細胞が残っています。 どうにかして溶解させようとしてピペッティングすると、かなり泡立ってしまいます。 実験自体はなんとか行えているのですが、大量の細胞の溶け残りが気になります。 Cell Lysis Bufferできれいに細胞を溶解させるコツがありましたら、ご教示いただけますでしょうか。

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