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(無題) 削除/引用 No.1168-7 - 2012/11/20 (火) 18:35:16 - くろすけ おお様 ＞あなたの必要なRNAだけが逆転写されればいいのでrandom primerやOligo dTは必要ありません。 ＞side by sideでrandom primer and/or Oligo dTとスペシフィックプライマーだけのものをやっておけば、万が一スペシフィックプライマーが逆転写にあまりよくなくっても、random primer and/or Oligo dTから増幅できるのでより安全かと。 詳細に教えて下さって、ありがとうございます。 おかげで疑問に思っていた点が全てすっきりと解決致しました。 また何かあった際には是非宜しくお願い致します！

(無題) 削除/引用 No.1168-6 - 2012/11/19 (月) 22:56:13 - おお >[Re:5] くろすけさんは書きました : > > この話は初耳でした。 > これは、random primerやOligo dTと併せてリバースプライマーを入れるということでしょうか？ あなたの必要なRNAだけが逆転写されればいいのでrandom primerやOligo dTは必要ありません。 side by sideでrandom primer and/or Oligo dTとスペシフィックプライマーだけのものをやっておけば、万が一スペシフィックプライマーが逆転写にあまりよくなくっても、random primer and/or Oligo dTから増幅できるのでより安全かと。

(無題) 削除/引用 No.1168-5 - 2012/11/19 (月) 19:54:03 - くろすけ おお様 ＞必要な部分を増幅するわけで選択肢がないと思っていますのでプライマーダイマーの形成もチェックしません。末端は一方をGGCC、他方をGCGCといった具合です。まったんはGとCだけで作った方がにほんさが安定するので酵素処理とかそちらのほうがいいと一応いわれています。 了解致しました。 GCのみで作ってみようと思います。 具体例まで挙げて教えて下さってどうもありがとうございます。 ＞RNAからの場合は、今回作ったリバースプライマーで逆転写反応をするとノンスペを拾う確率が減ると思います。 この話は初耳でした。 これは、random primerやOligo dTと併せてリバースプライマーを入れるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1168-4 - 2012/11/19 (月) 01:05:48 - おお >[Re:3] くろすけさんは書きました : > ということは、適当に塩基を選んで、ざっと見てダイマー形成等の可能性が低そうな配列であればそのまま合成に進むということでしょうか？ 必要な部分を増幅するわけで選択肢がないと思っていますのでプライマーダイマーの形成もチェックしません。末端は一方をGGCC、他方をGCGCといった具合です。まったんはGとCだけで作った方がにほんさが安定するので酵素処理とかそちらのほうがいいと一応いわれています。 > テンプレートの記載を忘れていました、すいません。 > 後者の方法です。 RNAからの場合は、今回作ったリバースプライマーで逆転写反応をするとノンスペを拾う確率が減ると思います。

(無題) 削除/引用 No.1168-3 - 2012/11/18 (日) 23:26:29 - くろすけ おお様、迅速な返答有難うございます。 ＞あまりtmに振り回される必要もないかと思います。3ー4塩基で末端が近いことに影響をあまり受けない酵素でを選んでいる限りはそれで機械的につけておしまいにしています。 ということは、適当に塩基を選んで、ざっと見てダイマー形成等の可能性が低そうな配列であればそのまま合成に進むということでしょうか？ ＞テンプレートがプラスミドなどであれば、そんなにプライマーの性質に神経質になる必要もないかと思います。RNAからcDNAをつくってあなたの興味あるものを増やすのであれば、１度そういうふうに作ったプライマーで増やしてみて、厳しいようであればタグなしをさらに合成してnestedでやるといいかと思います。 テンプレートの記載を忘れていました、すいません。 後者の方法です。

(無題) 削除/引用 No.1168-2 - 2012/11/18 (日) 16:32:49 - おお あまりtmに振り回される必要もないかと思います。3ー4塩基で末端が近いことに影響をあまり受けない酵素でを選んでいる限りはそれで機械的につけておしまいにしています。テンプレートがプラスミドなどであれば、そんなにプライマーの性質に神経質になる必要もないかと思います。RNAからcDNAをつくってあなたの興味あるものを増やすのであれば、１度そういうふうに作ったプライマーで増やしてみて、厳しいようであればタグなしをさらに合成してnestedでやるといいかと思います。 どうしてもtmを気にするなら内側に伸ばしたりするのも手だと思いますけど。

インサート用プライマーの設計 削除/引用 No.1168-1 - 2012/11/18 (日) 15:24:34 - くろすけ いつも拝見させて頂いております。 今回初めて、ある遺伝子のORFをインサートとしたベクターを作製し、 培養細胞にtransfectionすることになりました。 そのためのプライマー設計を行っていたのですが、 たとえば 5'-足場数mer-制限酵素サイト-kozak配列-target配列-3' のように組むことが多いかと思います。 そこで足場の塩基を選択する際には ・２つのプライマーで相補的な配列が出てこないか ・二次構造が形成されないか を確認することが重要だと考えたのですが、これは一つ一つ目で見て確認していくより他にないものなのでしょうか？ また、皆様はこの点についてはどの程度気をつけていらっしゃるものでしょうか？ 2~3塩基程度であれば選択の余地は少ないと思いますが、 今回GC含量とTm値の一致を考慮した結果、一方のプライマーに5〜6塩基付加しなければいけなくなり、困っています。 皆様の足場配列を決定する際のノウハウも含めてご教授頂ければ幸いです。 宜しくお願い致します。

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