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(無題) 削除/引用 No.11686-6 - 2023/08/08 (火) 20:21:42 - Tomomo おお様 コメントありがとうございます。 先のアドバイスに従って、Branch pointを確認しました。 Exon2−Exon3の間のIntron中に、真ん中よりややExon3寄り(3’側）にBranch pointがありました。 BPの上流側に十分なスペースがあることを確認出来ましたので、「３’側BPと5'側のちょうど真ん中あたり」にloxPを挿入しようかと思います。 ちょうどその当たりに良さそうなgRNAの候補が複数ありますので、なんとかなりそうです！ ありがとうござました。

(無題) 削除/引用 No.11686-5 - 2023/08/08 (火) 12:53:20 - おお ＞5'側は10ベースは開けるようにします。 できればそれぐらいは必要かなと思うわけですが、離したほうがいいので、３’がわBPと5'側のちょうど真ん中あたりというのが無難かなと思います。

(無題) 削除/引用 No.11686-4 - 2023/08/08 (火) 08:34:19 - Tomomo AA様 コメントありがとうございます。 やってみなければ分からないというところですよね。承知しました。 幸いgRNAは良い位置に候補が複数ありますので、なんとかなるかなと思っています。 おお様 コメントありがとうございます。 Intronの3'側は十分な距離を取り、5'側は10ベースは開けるようにします。 指摘頂いた配列の有無についても確認しておきます。 WEBのアルゴリズムも探してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11686-3 - 2023/08/05 (土) 03:28:35 - おお https://www.cell.com/trends/genetics/fulltext/S0168-9525%2820%2930297-3 こちらのFig1をご覧ください とくにIntronの３’側に必要な配列が配置されています。少なくともも polypyrimidine tractとbranch pointの上流にloxPを入れるようにしないとスプライシングが阻害される可能性が大きいと思います。 ５’がわはスプライシングされる位置前後数ベースが保存されていれば何とかなると思います。ま、１０ベースぐらいは最低でもはなしたいかなと。 非常に強いスプライシングサイトは、図に示される部分があればしっかりスプライシングされます。 スプライシングの強さと図にあるスプライシングのコンセンサスの位置を予測してくれるアルゴリズムがありWEBで探せば見つかると思います（大昔に使ったことがある）。時間があれば探してみますが、、、

(無題) 削除/引用 No.11686-2 - 2023/08/04 (金) 18:23:28 - AA 残念ながら >>遺伝子･ExonによってはloxP挿入が影響しないこともあるので、やりたいならやってみたら というのが実情だと思います。 私がfloxマウスを請け負ったのであれば近接しているexonはまとめて欠損させるデザインを推奨します。 今回は特定のexonのみを標的にするしか無いということですので、やってみるしか無いんじゃないでしょうか。 スプライシングに影響しないようにexonから3−40塩基は触らない方がいいので、100塩基しか無いのであれば実質ガイドの選びようがないという可能性も覚悟されたほうが良いですし、切れないガイドを無理に使おうとするとマウス自体が作出できないので実験を開始される前によくよく検討されることをお勧めします

loxP挿入部位とExonとの距離 削除/引用 No.11686-1 - 2023/08/04 (金) 16:43:07 - Tomomo Floxedマウスの作製を計画しています。 マウスの遺伝子AのExon3の前後にloxP配列を挿入しようかと考えています。 問題は、Exon2-Eonx3間、またExon3-Exon4間のイントロンはともに100nt程度の長さです。 「Exonから200nt程度は離してloxPを挿入するのが良い」とは、教わっているのですが、50nt程度の距離になっても遺伝子Aの発現に大きな影響なくすむでしょうか。 「遺伝子、Exonによる」という返答になるかとは予想しますが、「絶対してはいけない」のか、それとも「遺伝子･ExonによってはloxP挿入が影響しないこともあるので、やりたいならやってみたら」という返答になりますでしょうか。 ※諸事情で他のExonを標的とすることは今回は出来ません。 このマウスに限らず、loxPを挿入しても大丈夫な領域かどうかを推測するようなツールはありますでしょうか。 よろしくお願いします。

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