BioTechnicalフォーラム [ウエスタンの2次抗体処理]

ウエスタンの2次抗体処理

No.11689-TOPIC - 2023/08/05 (土) 02:11:51 - ま

ウエスタンブロットで複数の抗原（抗原A、B、C、D用の膜が計4枚ありいずれも2次抗体として抗マウス抗体を必要とする）を同時に検出するとき、2次抗体の処理は個別の膜ごとに行ったほうがよいのか、それともまとめてひとつのメンブレンケースで処理しても差し支えないのかご存じの先生いらっしゃいますか。1次抗体処理は別々に行っていてTBS-Tweenでの洗浄も行っているので問題ないのかなとは思っているのですが、ノンスペが出たりするものなのか気になってこれまでやってきませんでした。
　

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No.11689-7 - 2023/08/16 (水) 02:00:10 - ま

皆様、ありがとうございます。1次抗体のターゲットが異なる場合は2次抗体も別々に処理したほうがよい、とのこと、そしてその理由がよくわかりました。ありがとうございました！

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No.11689-6 - 2023/08/05 (土) 18:50:02 - G25

同じ一次抗体で複数のメンブレンを反応する場合は、一次抗体も二次抗体も複数枚混浴で処理します。スタックして液の当たりがむらにならないように配慮しますが、これはまた質問とは別の話。

余談ですが、
抗体を節約するため、使用済みの抗体反応液を回収して再利用することがあります。
腐らせないようにすれば2、3回は十分に使えます(それ以上行けそうだけど、その前に用が済んでしまってやったことがない)。
ただし、二次抗体を再利用するときは、同一の一次抗体で処理したものだけにします。
異なる一次抗体の場合、前に使った一次抗体がモノから剥がれてコンタミしていて、その標的も検出されてしまうから

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No.11689-4 - 2023/08/05 (土) 16:46:19 - G25

一方のメンブレンに反応させた抗体が、他方のメンブレンに移ってバンドが検出されてしまうことがあるのでやりません。

抗原抗体反応は不可逆反応ではなく、エンドポイントでも結合/解離が平衡しているだけです。
一次抗体が入っていない二次抗体液の中では抗原にくっついている一次抗体は解離してきて、別のメンブレン上の標的にも反応しうる。

抗原抗体によって解離係数も違うし、どのくらいの量の抗体がメンブレンに捕捉されているのかも標的タンパク質の量が違えば変わってくるのでしょうから、いつでも必ず目に見えるくらいの「cross reaction」が起こるわけではないけど、危険です。

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No.11689-3 - 2023/08/05 (土) 15:00:15 - K

原理的には可能ですが、実際にやってみればわかりますが、膜どうしが重なって部分的にくっついたりして、すべてのメンブレンに（もしくは１枚のメンブレン上にすべての領域に）均等に抗体液が行き渡り反応できているかはかなり不安になります。実際、反応のムラではないかとおもわれるような結果が出たりすることもあると経験者から聞いています。ですので個別の容器で１枚づつやったほうが安心で確実と思います。

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No.11689-2 - 2023/08/05 (土) 03:10:46 - おお

私は別々にやります。例えばアクチンと過剰発現したGFPとかは一度抗原についたものからリークしてきてほかのメンブレンに移り、すべてのメンブレンでバンドが検出されるという事が起こったりします。抗原の量、抗体の吸着力にもよるので、そういったことがいつも起こるわけではありませんが、特異的と思ったバンドが実はそういう原因からくるノイズだったとかいう事になると面倒なので。

ウエスタンの2次抗体処理

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No.11689-1 - 2023/08/05 (土) 02:11:51 - ま

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