BioTechnicalフォーラム [dCas9i/aのsgRNA設計方法について教えてください]

dCas9i/aのsgRNA設計方法について教えてください

No.11693-TOPIC - 2023/08/07 (月) 15:29:19 - 初心者

いつも勉強させていただいております。
研究室に入って数ヶ月の学部4年生です。

dCas9 i/aのsgRNA設計方法について教えてください。
ヒト由来の培養細胞に対して、レンチウイルスを用いてdCas9 i/aの恒常発現細胞を樹立した後、再度レンチウイルスでsgRNAを導入して、dCas9 i/a発現細胞を作りたいと考えています。

最初のdCas9 i/a発現細胞は、ウェスタンブロットで発現を確認しているので問題ありません。
2回目のsgRNAの導入のところで、どのように (認識配列の場所、sgRNA handle?の配列の有無) sgRNAを設計すればよいかわからず困っています。

ttps://limlab.ucsf.edu/pdfs/larson_2013.pdf
上URLの論文ではFig3aにあるようなdCas9 handle配列をチェックするようにかかれていますが、CRISPickのような予測サイトではこの配列がないように思います。
ttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public/how-to-use

また、CRISPickで上がってくる配列は転写開始点上流250 bpぐらいまであがってきますが、先の論文ではざっくりとTFBSにあればよいとなっていて、具体的にどれほどまで許容されるかがわかりません。

設計について詳細が記してある総説や書籍などご存知でしたら、教えていただきたいです。

使用しようとしているプラスミドは以下の通りです。
・psPAX2
・pMD2.g
・pXPR_120 (dCas9a発現用)
・pXPR_123 (dCas9i発現用)
・lenti-sgRNA puro (sgRNA発現用)
(MS2ループというのがあったほうが良いのでしょうか？)

先輩はおらず、教授もよく考えなさい、としか言ってくれません…
毎日色々な参考書を読んで理解しようとしていますが、実験が進まず苦しいです。
情報が不足しているところがあったら申し訳ありません。

どうかよろしくお願いいたします。
　

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(無題)

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No.11693-9 - 2023/08/09 (水) 23:06:34 - 初心者

AA 様、ossi様

ご返信大変ありがとうございます。

>初めにお示しされたpXPR_120ではdCas9に何が転写活性化ドメインとして融合されていますでしょうか？
また、フナコシのサイトではMS2アプタマーは何を誘引すると記載されていますでしょうか？

>初心者さんが使おうとしているpXPR_120とpXPR_123はdCas9と転写活性化/抑制化ドメインの融合タンパク質の発現ベクターです。

初歩的なところからご指摘いただき本当にありがとうございます。
pXRP_120では、dCas9-VP64-RelA(AD)-Rta(AD)がひとつのタンパク質として近接した状態で翻訳されるため、MS2アプタマーが持つVP64にRelAを誘引させる作用は必要ない、ということで理解できました。
文字を読んで理解しているつもりで、何も理解できていなかったことを痛感いたしました…
お示しいただいたLei S QiグループのCellの論文にもあたって正確に把握するようにいたします。

みなさま、ご親切にご指導くださりありがとうございました。

(無題)

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No.11693-8 - 2023/08/09 (水) 18:37:38 - ossi

> >(2) MS2 RNAアプタマーを含む修飾gRNA
> >MS2-p65-HSF1融合タンパク質（●●●）のMS2（●）が，gRNAに含まれるMS2 RNAアプタマー（MS2 RNAアプタマーのイメージ）と結合し，p65（●）とHSF1（●）をVP64に引き合わせ，VP64，p65，HSF1が相乗的に遺伝子発現を活性化する。
>
> このように記載がありますが、先に示したlenti-sgRNA puroにはMS2アプタマー部分がありませんでした。つまり、CRISPRaを効率よく活性化するにはMS2アプタマーが必要という理解であっていますでしょうか？
> また、手元にはMS2アプタマーを含まないものしかありませんが、こちらでは難しいでしょうか？
> もしご存知でしたら教えていただきたく存じます。
> どうぞよろしくお願いいたします。

初心者さんが使おうとしているpXPR_120とpXPR_123はdCas9と転写活性化/抑制化ドメインの融合タンパク質の発現ベクターです。
MS2は必要ないので無視して大丈夫です。

MS2はdCas9とMCP-転写活性化/抑制化ドメインを別々に発現させた後、複合体上でドッキングさせる目的で使用します。
Lei S QiグループのCellの論文(自分で探してみて下さい)を読めばその特徴・利点が分かりやすいと思います。

> 毎日色々な参考書を読んで理解しようとしていますが、実験が進まず苦しい

ということですが、自分で考えつつ資料を探して別ラボの技術を導入することはとても良い経験になります。
教わったことをやっただけで博士を取ってしまった人だと、これができずに後で苦労することになります。
失敗が許されるのも若い人の特権です。
実験をしてみて理解が深まることも多く、予算の許す範囲で失敗してみるのも悪くないと思います。
頑張って下さい。

(無題)

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No.11693-7 - 2023/08/09 (水) 18:27:13 - AA

CRISPRa/iはCas9の配列認識能をもちいて転写制御因子を目的遺伝子の被制御座へ誘引してくるというのがその基本的な原理です。
したがって、活性にしろ抑制にしろ、ご自身の実験系で具体的にどんな分子が制御因子として用いられているかを理解していただかなければいけません。

初めにお示しされたpXPR_120ではdCas9に何が転写活性化ドメインとして融合されていますでしょうか？
また、フナコシのサイトではMS2アプタマーは何を誘引すると記載されていますでしょうか？

一口にCRISPRa/iといっても様々な仕組みが出回っています。
ご自身が使用されるのがどの実験系なのか、よく理解してから始めないとトラブルシューティングのときなどに間違った情報を参考にしてしまうこともありえます。

(無題)

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No.11693-5 - 2023/08/09 (水) 15:49:03 - 初心者

AA　様

ご返信いただきありがとうございます。
お示しいただいたページを拝見させていただきました。

>(2) MS2 RNAアプタマーを含む修飾gRNA
>MS2-p65-HSF1融合タンパク質（●●●）のMS2（●）が，gRNAに含まれるMS2 RNAアプタマー（MS2 RNAアプタマーのイメージ）と結合し，p65（●）とHSF1（●）をVP64に引き合わせ，VP64，p65，HSF1が相乗的に遺伝子発現を活性化する。

このように記載がありますが、先に示したlenti-sgRNA puroにはMS2アプタマー部分がありませんでした。つまり、CRISPRaを効率よく活性化するにはMS2アプタマーが必要という理解であっていますでしょうか？
また、手元にはMS2アプタマーを含まないものしかありませんが、こちらでは難しいでしょうか？
もしご存知でしたら教えていただきたく存じます。
どうぞよろしくお願いいたします。

(無題)

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No.11693-4 - 2023/08/09 (水) 13:00:12 - AA

フナコシのページが比較的初学者にわかりやすいのではないかと思います。
ttps://www.funakoshi.co.jp/contents/67306

一般論的にガイドRNAは予測ツールで決め打ちしても良いことはなく、ツールで良い評価のものを複数作成してそれぞれを実際に使って比較し、良い結果を示すものを使うというのが通例だと思います。

ガイドがゲノム上のどういうところに設計されるのかは、よく勉強していただくと同時にCRISPickで実際にどういうところが選ばれるのかをみて勉強されるのが良いかと思います。

(無題)

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No.11693-3 - 2023/08/09 (水) 11:57:57 - 初心者

あああ　様

ご返信んいただき大変ありがとうございます！
また、Webページについてもご教授いただき心から感謝申し上げます。

>バイオ系ならCRISPR/Cas9の原理知っているかと思いますが、そこはtracrRNAにあたる部分でgRNA共通の必須配列です。
CRISPR/Cas9で変化させるのはその前crRNAの部分で、設計ツールではここをデザインしてます。
じゃあtracrRNAについてはどうすればいいですか？という質問に対しては材料であるプラスミドのデザインや配列を調べてください、と返します。

この部分が明確に理解できていないことがわかりました。
上げていただいたサイトなどでよく勉強いたします。

自身の持っているプラスミドの配列から見直します！
ありがとうございました！

(無題)

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No.11693-2 - 2023/08/09 (水) 11:16:35 - あああ

手動だと面倒なので普通にCRISPicなどのgRNA設計ツールでいいと思いますが…

>上URLの論文ではFig3aにあるようなdCas9 handle配列をチェックするようにかかれていますが、CRISPickのような予測サイトではこの配列がないように思います。

バイオ系ならCRISPR/Cas9の原理知っているかと思いますが、そこはtracrRNAにあたる部分でgRNA共通の必須配列です。
CRISPR/Cas9で変化させるのはその前crRNAの部分で、設計ツールではここをデザインしてます。
じゃあtracrRNAについてはどうすればいいですか？という質問に対しては材料であるプラスミドのデザインや配列を調べてください、と返します。

下記のような初心者向けサイトもありますし意味不明なまま参考書を読むよりネットで調べていく方がスマートだと思いますよ。

ttps://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/gene-editing_bid_ts_2/

dCas9i/aのsgRNA設計方法について教えてください

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No.11693-1 - 2023/08/07 (月) 15:29:19 - 初心者

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