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(無題) 削除/引用 No.11697-13 - 2023/08/10 (木) 15:36:12 - おお >[Re:7] 組換えタンパク質さんは書きました : > おお先生、さく先生、のなめ先生、 > > これでしたら、グルタチオンで精製し、さらにNi-NTAで精製後、Prescission protease-Hisで切断できないか思いつきました。しかし、末端ではなく内部にHisタグを配置させても精製できるのか経験がありません。 > > もしご存知でしたら、追加で質問での大変恐縮ですが、どうかご教示いただけましたら幸いです。 グルタチオンは還元型を使うし、それをサポートするためにDTT使いますよね、、、

(無題) 削除/引用 No.11697-12 - 2023/08/10 (木) 15:27:32 - おお >[Re:7] 組換えタンパク質さんは書きました : > おお先生、さく先生、のなめ先生 > > GSTタグ-His6-Prescission protease配列-興味あるタンパク質 > > これでしたら、グルタチオンで精製し、さらにNi-NTAで精製後、Prescission protease-Hisで切断できないか思いつきました。しかし、末端ではなく内部にHisタグを配置させても精製できるのか経験がありません。 > > もしご存知でしたら、追加で質問での大変恐縮ですが、どうかご教示いただけましたら幸いです。 pETシリーズの中にはN末側のHisx6の前にさらに他のタグを持ったプラスミドが売られています。タグがなくとも、N末なら最低M(開始コトン)が必要なので完全に末端である必要がない事がわかります。実際、pETシリーズでN末にHisx6があるものでも、MGSSHHHHHH…となっている。理屈で言ってもヒスチジン残基がにビーズに結合する訳で周辺領域の制約はありません。強いて言うなら露出していてアクセス可能であることが必要という事。

(無題) 削除/引用 No.11697-11 - 2023/08/10 (木) 13:35:55 - K TEV protease 認識配列入れてました。効率よくしっかり切れました。

(無題) 削除/引用 No.11697-10 - 2023/08/10 (木) 11:32:43 - 組換えタンパク質 のなめ先生 ありがとうございます。 納得いたしました。そのようにデザインしてみます。 Precision proteaseのバッファーを見ると、DTTが入っていますね・・そうなると目的タンパク質のジスルフィド結合が切れてしまうと想像します・・ こういう酵素に含まれるDTTは、基質の立体構造を切れやすくするために含まれているのでしょうか？ならば、DTTがなくても基質は切れることもある、と考えることはできると思います。 一方、DTTがPrecision proteaseの活性に必要ということもあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11697-9 - 2023/08/10 (木) 11:32:39 - 774R >GSTタグ-His6-Prescission protease配列-興味あるタンパク質 それはやったことはないですが、GSTとHisが逆のバージョンなら上手くいったことあります。 6xHis-GST-切断配列-目的タンパク質 FactorXaのメリットは切断認識配列のC末端で切れるので、目的タンパク質のＮ末端を任意の配列に出来ることですね。

(無題) 削除/引用 No.11697-8 - 2023/08/10 (木) 10:23:31 - のなめ 透析しながらPrescission proteaseでタグを切断後、もう一度グルタチオンビーズを通すこと切断させたタグ、proteaseをビーズにくっつけ、目的タンパク質は素通りさせればC末にHisタグが付いていても問題ないと思いますが。。。

(無題) 削除/引用 No.11697-7 - 2023/08/10 (木) 09:59:36 - 組換えタンパク質 おお先生、さく先生、のなめ先生、 FactorXaは切れが悪いご経験がおありとのこと、大変有益な情報をいただきまして、ありがとうございます。 経験に基づいたご意見でしたので、本当に嬉しいです。 皆様からのコメントを参考に、Prescission proteaseが良さそうとの印象を持ちました。 ただ一つ問題がありまして、現在、私のタンパク質のC末にhisタグを付加しております。 tandem（GSTとHis6）affinity purificationのためです。 現在のデザイン GSTタグ-Prescission protease配列-興味あるタンパク質-His6タグ Prescission proteaseがHisタグが付加されていることを考えると、His6タグをC末に持たせることはできなさそうです。 一つお聞きしたいのですが、his6タグをタンパク質の内部に配置しても、Ni-NTAアガロースを使用して精製できますでしょうか？（以下のようなデザイン） GSTタグ-His6-Prescission protease配列-興味あるタンパク質 これでしたら、グルタチオンで精製し、さらにNi-NTAで精製後、Prescission protease-Hisで切断できないか思いつきました。しかし、末端ではなく内部にHisタグを配置させても精製できるのか経験がありません。 もしご存知でしたら、追加で質問での大変恐縮ですが、どうかご教示いただけましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.11697-6 - 2023/08/10 (木) 09:29:56 - のなめ 個人的な感想ですが、FactorXaは切れ味が悪い印象があります。 Prescission proteaseがその後のタグの回収も楽かと思います。(500 U, \32,500) 同じようなのがニッポンジーンから出てますね。こちらは1 mg, \30,000なのでCytivaのは大体1000 U=1 mgらしいので、ニッポンジーンのものはCytivaの半額ぐらいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11697-5 - 2023/08/10 (木) 09:27:56 - さく もう14,5年以上前に使いましたが、私の場合、FactorXaは切れが悪かったです。 プレシジョンプロテアーゼはあっさり切れて、メーカーがお勧めしているだけはあるなぁと思ったのと、私は発現系が大腸菌だったこともあり切った途端に不溶化したので、よく覚えています… そんなわけで、私であれば少量を取るぐらいであればとりあえずプレシジョンを選択します。 融合させているタンパク質にも依るかもしれませんので、ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.11697-4 - 2023/08/10 (木) 08:59:25 - おお うちはpGEX-6しかないので、、、 ごくまれにプロテアーゼ認識配列が目的のたんぱく質にあったりして、違うプロテアーゼを使う設計にしたという話を聞いたことがあるけど、、、

(無題) 削除/引用 No.11697-3 - 2023/08/10 (木) 08:12:18 - 組換えタンパク質 おお先生 ありがとうございます。 目的のタンパク質がジスルフィド結合を持つのでDTTは使えないんですよね。 ですが、そのような系があるとは知りませんでした。 おお先生はトロンビン、FXa、プレシジョンプロテアーゼでなら、どれを選ばれますか？ プロテアーゼを自作するまでは困窮はしておりませんが、そのような方もいらっしゃるのですね。

(無題) 削除/引用 No.11697-2 - 2023/08/10 (木) 01:06:49 - おお プロテアーゼなしで、DTTを加えるだけで切断できるプラスミドが売られているよ。 使用感はちょっとわからないけど。 https://www.neb.com/products/protein-expression/bacterial-e-coli-protein-expression/impact-system/impact-system そういえばだれかプロテアーゼもリコンビナントで自分で精製して使っていたやつがいたな、、、

組換えタンパク質精製時におすすめなプロテアーゼ 削除/引用 No.11697-1 - 2023/08/09 (水) 20:49:28 - 組換えタンパク質 いつも勉強させていただいております。 私は哺乳動物細胞にて組換えタンパク質の大量発現を目指しています。 GSTタグの後ろに興味あるタンパク質を配置させ、グルタチオンビーズで精製後、プロテアーゼでGSTタグの切断を行おうと思っています。興味あるタンパク質のC末にはわけあって、hisタグを付加しております。 このようなタンパク質は大腸菌発現でよくやられるかと思いますし、有名なpGEXシリーズがあるかと思います。 皆様にお聞きしたいのは、おすすめのプロテアーゼを教えていただきたいです。 トロンビン、FactorXa、Prescission protease等、様々なものが目的を叶えるためにあるかと思います。 このうち、おすすめ（切断効率、コストなど）はどれになりますでしょうか？ 特異性とコストを考えるとFactorXaかなとも思ったりしますが、ぜひ皆様のご意見をお聞かせいただけましたら幸いです。 また別のプロテアーゼをお使いとのことであれば、併せて教えていただけましたら幸甚です。

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