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(無題) 削除/引用 No.11702-15 - 2023/08/29 (火) 10:15:40 - G25 自分でもなんか変だと思ったけど、under-estimationじゃなくてover-estimationですね。 例えばこんな文献 https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0009545

(無題) 削除/引用 No.11702-14 - 2023/08/29 (火) 00:43:31 - おお >[Re:13] G25さんは書きました : > 現にqPCRのスタンダードとしてcccを用いるとlinearより増幅率が格段に低いのでunder-estimationになるってことは盛んに論じられていますね。 > これについて、論文があったので提示しようと思ったのですが、、、どっか行っちゃった。。。

(無題) 削除/引用 No.11702-13 - 2023/08/28 (月) 13:45:34 - G25 現にqPCRのスタンダードとしてcccを用いるとlinearより増幅率が格段に低いのでunder-estimationになるってことは盛んに論じられていますね。 一分子のプラスミドにnickが一箇所だけ、あるいは複数でも一方の鎖だけなら、もう一方の鎖は切断されていないので、inverse PCRの良い鋳型になるでしょう。 昔、プラスミドをキロシークエンスするとき制限酵素とExoIIIを使うテクニックの他に、プライマー近傍一箇所の制限酵素消化と、DNase Iの限定消化によるランダムな一箇所だけの二重鎖切断を組み合わせるという方法がありました。そんな感じで、DNase Iで一箇所だけnickを入れる（実際はnickの数はバラけるだろうけど、一箇所のが多く生じるように条件設定して）ってのはどうだろう。反応液の金属イオンを二重鎖切断を起こすMn++ではなくnickingを起こしやすいMg++にしたりして。

(無題) 削除/引用 No.11702-12 - 2023/08/28 (月) 13:25:54 - あああ 鋳型の不要な部分を制限酵素で切って、フラグメントにしてからPCRするのはどうですか

(無題) 削除/引用 No.11702-11 - 2023/08/28 (月) 10:27:20 - AA 論理としてはもちろん合理的だとは思うんですが、プラスミド程度の大きさで複製フォークがストールするほどのねじれは蓄積するんでしょうか？ 20kとか大きなプラスミドのinvPCRでしくじることがあるのはそういうことなのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11702-10 - 2023/08/28 (月) 09:17:27 - 散々 >[Re:9] 中年さんは書きました : > ニックを入れるような操作をすれば効率が上がるのではないかと思います。 ニックはつまり片側が切れてるって事だから、どう影響するか。 モデルナ社に買収されたオリシロ社の技術がまさに、溜まったねじれを解放する技術でした。

(無題) 削除/引用 No.11702-9 - 2023/08/22 (火) 09:28:45 - 中年 もしそうなら、本トピックに直接関連することとして、ニックを入れるような操作をすれば効率が上がるのではないかと思います。あくまで思いつきで実際の経験があるわけではありません。

(無題) 削除/引用 No.11702-8 - 2023/08/22 (火) 07:53:39 - 中年 前にも質問して回答が得られなかった便乗質問なのですが、cccのプラスミドを鋳型にinverse PCRに代表されるような"ほぼ全長を"増幅するようなPCRを行うときって、有効に鋳型として機能できてるプラスミドはnickが入って1本鎖に分離できるようなminor fractionだけってことはないですか？ ポリメラーゼが複製を進めるにつれて複製フォークの先の捩れが蓄積するので、複製は途中で止まるんじゃないかって思ってるんですけど。

(無題) 削除/引用 No.11702-7 - 2023/08/12 (土) 11:11:35 - toto inversePCRは変異やdeletionを入れるのによく使ってますが、よほど偏ったものでなければ、必ずできます。reverseは33mer程度で、templateとフルマッチで、forwardでそのreverseのとoverlapする24merを含む配列と、変異を入れたい配列と、その3'端の33mer程度にします。KodOneの標準サイクルで、anealを60-63度です。あとは、ゲル精製したフラグメントをNEBiulderで繋いでtransformするとものすごい数のコロニーが取れます。

(無題) 削除/引用 No.11702-6 - 2023/08/12 (土) 09:46:22 - mutant 多分それなりに条件は振ってるんだろうけど スメアすらないなら変異入れないポジコンで そもそもPCRがかかるかから試してみるとか 自分は数種同時にやる時は一発で全種バシっと出ることはないから 最初キツめの条件でやってますね ベクターも違うから共通の傾向ではないだろうけど一例として 温度55〜80℃ サイクル30〜40 テンプレート100pg〜1000pg 感覚では 50台でなにか出るなら60台でも出るから温度ふり幅は多め テンプレートは濃い目でコロニー出してから鋳型由来を取り除く方がマシ primer自体を長くしたり短くしたり、別の発注して最初の条件に戻すほうが 結果的に早く済んだケースが多い

(無題) 削除/引用 No.11702-5 - 2023/08/12 (土) 09:46:17 - AA inversePCRはプライマーの設計が産物に依存してしまうので、PCRが走りにくい設計になっていることがあります。 酵素をより良いものにすることで変わることもありますが、経験上主な原因はプライマー自身にあることが多いです。 ペアのTm値を揃えたり、鋳型相補配列の長さを変えたり、いろいろ試してダメそうなら人工合成するしか無いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11702-4 - 2023/08/12 (土) 02:38:55 - eee 結論を言いますと時間とお金の無駄なので、代用可能なら、人工オリゴ等作成されるのがいいです。

(無題) 削除/引用 No.11702-3 - 2023/08/12 (土) 02:24:07 - おお ま、ポリメラーゼを変えるというのは意外と条件をいじるより確実だったりもします。 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PrimeSTAR などかこれらをHotStartにしたようなものがよく走るようです。ほかにもあるかもしれませんが、KapaとかはHigh-Fidelityに適用しているかわかりませんが、よく走るには走ります。 しいて言えばベタインなど加えるぐらいはやってもいいかもしれません。 また、PCRはちゃんとアニーリングする場所があれば増幅するというものでもなく、かかりにくいプライマーもいろいろ設計してみたらぶち当たったりします。 Nested PCRの要領で最初は２０塩基ではなく１０塩基ぐらいを５’に付加したプライマーを使い増幅し（実際増幅できるのがわかれば１０サイクルも回さなくてもいい）、残り１０塩基を付加した３０merぐらいのプライマーで再度増幅するといったようなやり方もあります（バリエーションは上げたらきりがないほど多くあります）。場合によってはいま手元にあるプライマーで数回増幅して、末端２５merぐらいのプライマーで再増幅という手も取れなくはない。 また、２０塩基を付加してないプライマーで増やしてしまい、挿入したい配列のオリゴをリン酸化しておいた状態でLigationしてしまうとか、一層のことベクター内のユニークな制限酵素認識配列を利用して２ピースにするとか。

(無題) 削除/引用 No.11702-2 - 2023/08/11 (金) 22:15:44 - UX いろいろやってダメな時は、（１）ポリメラーゼを変える、（２）プライマーのアニーリング部分を長くしてみる、をおすすめします。

Inverse PCRが増幅しない 削除/引用 No.11702-1 - 2023/08/11 (金) 21:55:46 - PCR Inverse PCRのトラブルに関する質問です。 pET44aを鋳型として、Inverse PCRをおこなっていますが、エキストラバンド、スメアも含めて全くPCRがかかりません。当初PCRは2STEPで行なっていましたが、3STEPに変更し、アニール温度を50℃まで下げましたが結果は変わりませんでした。 FプライマーおよびRプライマーの概要としては、それぞれ3'末端側にプラスミドアニール部分約20塩基に加えて、5'末端側に約20塩基の付加配列をつけてあります。 考え得る原因やこのような経験がある方は解決策をご教授いただけますと幸いです。

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