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(無題) 削除/引用 No.11703-11 - 2023/08/15 (火) 10:36:11 - あああ ブランクとの差が小さくて困っているということだから、オリゴdTでpolyAに精製するのがいいと思う。 検出の感度は上げてもブランクとの差が縮まらないと思う。

(無題) 削除/引用 No.11703-10 - 2023/08/15 (火) 02:05:48 - おお 理想的には１コピーあれば検出できるのは本当だし、実際にやられていると思う。ただ検出系に専念して系を作り上げる余裕がない（わかったコピー数を増幅してバックグランドと十分に差が出るなど検証するなどのステップを踏まない）、発現量の差を見たいラボがたいていだと思う。そういう系ではバックグランド（ノンスぺやプライマーダイマーなど）が検出限界に近い当たりでシグナルが出ることはまあまあ聞きます。 プライマーを変えたりしながらいい系を見つけるのも手かもしれませんが、ノンスぺよりより優位にターゲットが増えるような工夫が私は現実的かと思っています。 あと指摘がありますが、タックマンプローブに変えるほうがいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11703-9 - 2023/08/12 (土) 22:35:15 - あの ブランクの立ち上がりって、メルトカーブのTm 値からプライマーダイマーってこと無いですか？ 徹底した、(特にブランクのウェルの) コンタミ対策はしていますか？

(無題) 削除/引用 No.11703-8 - 2023/08/12 (土) 20:43:28 - が SyberGreenの検出系ではなく、Taqman系の検出系にスイッチすべき。

(無題) 削除/引用 No.11703-7 - 2023/08/12 (土) 19:49:46 - おお >[Re:5] 774Rさんは書きました : > スペシフィックプライマーは検出感度を上げるが、リアルタイムPCRの目的が定量なら、何をリファレンスにしたらいいのか分からなくなる。 スペシフィックとおりごdTまぜてもダメだろうか、、、 ターゲットと、インターナルコントロールのスペシフィックプライマーのミックスとかでもいける様に思うけど、、、

(無題) 削除/引用 No.11703-6 - 2023/08/12 (土) 19:34:09 - ベーカー 下水中などからSARS-CoV-2ウイルスを検出するのに数リットルの 検体中に1 コピーしか無くても検出は可能です。 極めて微量ってそういうレベルです。 ブランクが増幅してしまうのは論外なので、プライマー、プローブの 位置はしっかり選ばないといけません。

(無題) 削除/引用 No.11703-5 - 2023/08/12 (土) 18:09:59 - 774R スペシフィックプライマーは検出感度を上げるが、リアルタイムPCRの目的が定量なら、何をリファレンスにしたらいいのか分からなくなる。

(無題) 削除/引用 No.11703-4 - 2023/08/12 (土) 15:33:33 - あの ちなみにcDNAは、一反応あたりどのくらい使っていますか？ それからPCR酵素というかキットは何ですか？ 相当　少ない発現量でも、サイクル数を増やせば検出できるはずですが。

(無題) 削除/引用 No.11703-3 - 2023/08/12 (土) 14:32:14 - おお 因みにトータルRNAで数十マイクログラム有ればmRNA、1マイクログラム程度は取れる。

(無題) 削除/引用 No.11703-2 - 2023/08/12 (土) 14:28:41 - おお RTでランダムプライマーを使っているならオリゴdTにして、同時にスペシフィックプライマー加える。PCRで使うリバースのプライマーでいい。ついでになるべくmRNAのなるべく3‘側にアンプリコンを設定する。 念のためRT後RNaseH処理をする。 一層のことtotal RNA からmRNA を精製する。

リアルタイムPCRで極めて微量を検出する方法 削除/引用 No.11703-1 - 2023/08/12 (土) 14:02:46 - きなこ 3T3-L1細胞で発現が少なめのmRMAを追っています。 こちらをリアルタイムPCRで測定しようと思っているのですが、 立ち上がりがかなり遅い上に、ブランクの立ち上がりもその数サイクル後に位置しているため、検量線をひくのが極めて困難です。 プライマーいくつも作り直し、最も良いものを使っております。 そこでこれらを定量するため、ネステッドPCRとリアルタイムを掛け合わせて、 外側のプライマーで20サイクル程度PCRで増幅 ⇒一部を回収しリアルタイムPCRで定量 を考えているのですが、前例や報告等があまりなく悩んでいる状態です。 皆様の知恵をお貸しいただけると幸いです。

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