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(無題) 削除/引用 No.11706-15 - 2023/08/17 (木) 23:26:53 - FGVBHUI 免疫染色するならば、PFAでの固定時間はかなり重要で、培養細胞ならば１〜５分くらいが妥当。抗原や抗体の特性にもよるから、一般化はできないけど、PFA固定が長すぎると反応性があきらかにわるくなる傾向がしばしなみられ、時には全く染まらなくなることもある。抗原がいろいろとデリケートで、stopwatch見ながら１分程度の短時間で固定してる人も実際にいた

(無題) 削除/引用 No.11706-14 - 2023/08/17 (木) 19:43:46 - Nasu 皆さま 有難うございます。 頂いた意見を参考にしながらコーティング、固定時間、封入試薬などをいろいろ変えて試してみます。

(無題) 削除/引用 No.11706-13 - 2023/08/17 (木) 06:31:04 - あの 固定時間はネット検索すると、10から20分にしているところも多そうですね。 ただ当方では、たとえば次のようなところにある、 　http://www.labo.city.hiroshima.med.or.jp/wp-01/wp-content/uploads/2014/01/center200901-03.pdf 　“固定速度は一般的に 1 時間に 1mm 程度” という説から、細胞の厚さを念頭に、固定時間を色々検討してみて、単層の培養細胞なら1分を基準にしています。 なお細胞によっては、固定時間が長いと剥がれやすくなったりしたのもありました。これは細胞やコート剤などによると思います。 トピ主には、既に色々でている意見を参考にして、色々　検討してみて、どうなったか報告してもらえると、ありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.11706-12 - 2023/08/17 (木) 04:41:24 - おお >たった1分で良いのですか？我々のラボでは全ての細胞の固定に関して15分を標準として行っていました。 目的によりますが１分は不十分な場合も多いと思います。何を見るかによるということです。DAPIが浸透しないという観点なら１５分よりもっと長くてもいいのかもしれません。１時間とかオーバーナイトとか。浸透性がたかいホルマリンも選択肢かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11706-11 - 2023/08/16 (水) 10:20:31 - G25 補足 >染色前に0.3%程度のTx-100かTween20で10~30分くらい処理してみたらいかがでしょうか。 >あるいは変更可能であれば固定をアセトンやメタノールにするとか。 で、あとはDAPI入りのマウント剤でマウントするだけ。独立した染色のステップはなくてい良い。 DAPI入りのマウント剤は各社から様々な製品が出ていますが、 グリセロールでも構わなくて、home-madeでDAPIを添加してもよいです。 市販のマウント剤は蛍光免疫染色での仕様を想定していてanti-fade剤入が入っていますが、DAPI染色だけならなくても差し支えないかと思います。 多分、マウント剤がDAPIのリザーバになって退色にくいのかも。 DNAに結合したDAPIは希釈や洗浄では容易に解離しないと思いますが、 濃度の薄いDAPIで染色したあと洗浄するプロトコールは、染まりが悪そうな印象があります。

(無題) 削除/引用 No.11706-10 - 2023/08/16 (水) 07:57:05 - あふ 封入剤はグリセロールで良いのでしょうか？深く考えたことはないですが、DAPIが退色しやすい気がするので、私はフルオロマウントを使っています。

(無題) 削除/引用 No.11706-9 - 2023/08/15 (火) 16:06:53 - G25 DAPI染色は意外と透過処理で染まり具合が変わります。 透過処理をおざなりにするとぜんぜん染まらなかったりすることもあります。 多くの場合、多くのユーザーは、免疫染色のカウンターステインとしてやるものですから、透過処理を十分おこなった状態でDAPI染色しているわけで、DAPI染色における透過処理の必要性を意識しないのではないかと思います。 0.1%TritonX-100にDAPIを混ぜて一時間置くというのは、透過処理としては十分なような気もしますが、不十分かもしれない。染色前に0.3%程度のTx-100かTween20で10~30分くらい処理してみたらいかがでしょうか。 あるいは変更可能であれば固定をアセトンやメタノールにするとか。

(無題) 削除/引用 No.11706-7 - 2023/08/15 (火) 12:16:11 - おお コートの時間の長さは気になりますね。濃度などによって長さが違うかもしれませんけどね。染色に関係あるかわかりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.11706-6 - 2023/08/15 (火) 10:54:01 - 上司 染色性には関係ないところだろうけど、 >1. PLLをカバーガラスに乗せて常温でコーティング (3 overnight) コーティングなんて、１分で十分でしょうに、3 overnightって呑気すぎです。 吸着すれば水滴の撥き方が変わるから、吸着出来た事なんて一目瞭然だろうに。

(無題) 削除/引用 No.11706-5 - 2023/08/15 (火) 02:05:41 - Nasu > バックが上がるならともかく、染まらないのはなんか妙ですね。。。 > > Washは確かにあまり必要なく、DNAとの結合で４０倍ぐらい蛍光があ上がるので、のぞかず見るというのもよくやられます。た洗ったからと言ってそう洗い流されるものでもないですからね。。。 > > 細胞の形態的にはどんな感じに見えますか？ 細胞の形態は明視野で見る限り通常通りの元気なニューロンです。 少し細胞密度が高く、個々の細胞体の形態は見づらいですが、核自体はきちんとありそうです。 DAPIは染まらないときは全く染まらないですね…。

(無題) 削除/引用 No.11706-4 - 2023/08/15 (火) 02:03:17 - Nasu > その培養系を使ったことはありませんが、プロトコルの２点が気になります > (あくまで細胞が本当に最後まで残っているという前提です)。 > > (1) モノレイヤーの細胞培養ならば、PFAの固定は1分前後で十分では？ > > (2)DAPIの原液の濃度が不明ですが、たとえばドウジンドウのDAPIならば、2000倍希釈で共焦点顕微鏡観察に使っています。薄すぎるのでは？ > > なお染色がDAPIだけならば、PBSで3回洗いは不要だと思います。DAPI入りの封入剤が販売されているぐらいですから。 たった1分で良いのですか？我々のラボでは全ての細胞の固定に関して15分を標準として行っていました。 PFAを当てすぎて細胞に悪影響が出ている可能性もあるのでしょうか…。 DAPIのメーカーは何だったか忘れましたが、2000倍希釈だと組織の場合は染まりすぎてしまうので1万倍に希釈しています。 単純にもう少し濃いめで当ててみるのも手なのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11706-3 - 2023/08/15 (火) 01:35:42 - おお バックが上がるならともかく、染まらないのはなんか妙ですね。。。 Washは確かにあまり必要なく、DNAとの結合で４０倍ぐらい蛍光があ上がるので、のぞかず見るというのもよくやられます。た洗ったからと言ってそう洗い流されるものでもないですからね。。。 細胞の形態的にはどんな感じに見えますか？

(無題) 削除/引用 No.11706-2 - 2023/08/14 (月) 22:19:34 - あの その培養系を使ったことはありませんが、プロトコルの２点が気になります (あくまで細胞が本当に最後まで残っているという前提です)。 (1) モノレイヤーの細胞培養ならば、PFAの固定は1分前後で十分では？ (2)DAPIの原液の濃度が不明ですが、たとえばドウジンドウのDAPIならば、2000倍希釈で共焦点顕微鏡観察に使っています。薄すぎるのでは？ なお染色がDAPIだけならば、PBSで3回洗いは不要だと思います。DAPI入りの封入剤が販売されているぐらいですから。

神経細胞をDAPIできれいに染められない 削除/引用 No.11706-1 - 2023/08/14 (月) 19:28:13 - Nasu 私の研究室ではPLLで表面コーティングしたカバーガラスに神経細胞の初代培養を行っています。 これをPFAで固定後、封入前にDAPIで1時間ほど核染色を行っているのですが、しばしばうまく染まらないことがあります。 核がそもそも染まっていない場合もあれば、全体的に横線の入ったバックシグナル？のようなものが見えて核の染色が潰される場合など…。 組織切片では同条件できれいに染色が出来ているので、カバーガラスかコーティングに問題があるのではないかと考えているのですが…。 どなたか原因の分かる方、ご教示頂きたいです。 以下、詳細なプロトコルです。 1. PLLをカバーガラスに乗せて常温でコーティング (3 overnight) 2. 海馬神経細胞をカバーガラス上で初代培養(Neuro Basalメディウム) 3. メディウムを吸い取り、4%PFAを乗せて常温15分 4. PFAを吸い取り、PBSでwash×3 5. DAPIを0.1%TritonX-100が入ったPBSに1/10000希釈しカバーガラスに乗せて1時間常温 6. DAPI希釈液を吸い取りPBSでwash×3 7. グリセロールで封入

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