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(無題) 削除/引用 No.11711-10 - 2023/08/22 (火) 04:31:27 - おお リン酸化A/TotalAなのかリン酸化A/Internal controlなのか リン酸化A/TotalAが上がっていても、リン酸化A/Internal controlが下がっていたら、細胞内のリン酸化Aの影響は低下していることになります。ですから、まずはすべてのデーターをそろえるべきかと思います。 ストリッピングをするのかメンブレンをDuplicateなどするのか。 ストリッピングするのは確かに方法論としてあります。デメリットはストリッピングにより抗原性が減り極端な場合ストリッピングしないよう２枚膜を用意したものとかなり違いがあるように見えることがあります。なのでストリッピングは定量性という観点で劣化させているように思います。またECLPlus以降の試薬はシグナルがでた部分に色素が沈着し、その部分のHRPの反応性が低下することがあります。色素の色が見えるほどであれば、その部分はほとんどシグナルが出ません。なので私はなるべくDuplicateかそれ以上ですることにしています。 もし必要なら、２つ膜を用意してストリッピングした場合と、別々の膜で検出した場合でどの程度違うのか確認して、あなたの実験系において許容範囲か確かめてもいいかもしれませんが、どうでしょう。わざわざ確認ステップをとるなら別の膜で検出しちゃえばいいんじゃないのともおもいます。貴重なサンプルならちょっと違ってくるでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.11711-9 - 2023/08/20 (日) 12:47:00 - C BQQ様 詳しくご記載くださりありがとうございます。メンブレンの保管方法でやらかしているようなことはなさそうです。抗体のエピトープ部位は考えていませんでした。メーカーの方でもう少し調べてみます。 おお様 > > �@リン酸化Aを検出し、同じメンブレンをストリッピング→GAPDHやActinをコントロールとする > > or > > リン酸化AとTotalAを別メンブレンで検出する > > データとしては、どちらが望ましいと思われますか。 > > 最初のはGAPDHなどを基準にして、後者はTotalを基準にするという話ですか？それともストリッピングの影響を考えているのですか？ちょっと判断しかねます。 > 言葉が足りず申し訳ありません。両方です。 リン酸化の評価には、単一メンブレンでリン酸化タンパク質の検出→ストリッピング→Totalの検出を行い、TotalAを基準とするのが一般的であると感じています。（少なくても私のラボでは） しかし今回のようにストリッピング→TotalAが上手くいかない場合、�@単一メンブレンにこだわり、基準をhouse keepingに切り替えるもしくは�Aリン酸化A/TotalAにこだわり、それぞれを別メンブレンでとるという方法にしても良いのか判断しかねています。 そもそも、ストリッピング→リプロービングはみなさま節約目的なのか、信ぴょう性のためなのか、どっちが主なのですかね。

(無題) 削除/引用 No.11711-8 - 2023/08/18 (金) 00:50:34 - おお >[Re:5] Cさんは書きました : > ウェスタン有識者様かとお見受けしますので、追加でお聞きしてもよろしいでしょうか。 > > �@リン酸化Aを検出し、同じメンブレンをストリッピング→GAPDHやActinをコントロールとする > or > リン酸化AとTotalAを別メンブレンで検出する > データとしては、どちらが望ましいと思われますか。 最初のはGAPDHなどを基準にして、後者はTotalを基準にするという話ですか？それともストリッピングの影響を考えているのですか？ちょっと判断しかねます。 > > �A普段、ウォッシュの時間はどれほど厳密になされていますか。 Washは抗体の特異的な親和性と非特異の相互作用の強さなど、抗体に依存するので至適条件を見つけるしかないとは思いますが、わたしはほかの実験の合間にWBの作業をやるので毎回結構違います。どちらかというと長めになっていると思います。

(無題) 削除/引用 No.11711-7 - 2023/08/18 (金) 00:42:45 - おお >[Re:4] Cさんは書きました : > おお様、ありがとうございます。 > シグナルの強度は考慮していませんでした。リン酸化の方が発現量が少ないはずなのと、ストリッピングによるダメージを受ける可能性もあると聞いたのでこの順にしていました。 可能性をいうだけなら、ターゲットのエピトープ部位のアミノ酸がダメージ受ける可能性もあるからねぇ。。。リン酸化アミノ酸だけ特別扱いなのはなぜでしょう。サンプルバッファーでボイルしても外れてないのだけどね。 > > > ストリッピング後2次抗体だけで反応させバンドが出ない事を確認するべきでは。 > なるほど。この場合出ないことを確認後、また2次抗体を落とす用のストリッピングをしますか？ バンドが出ないんだから抗体は結合していません。なのになぜストリッピングするのですか？ま。気になるなら次のブロッキングの時にアサイドでも入れておけばいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11711-6 - 2023/08/17 (木) 21:00:08 - BQQ 1)抗体が問題なく働くものならば、普通にできます。 ２）特にリン酸化抗体だからという話ではなく、続けて実験するのが嫌になった時などは、ストリッピング前もしはストリッピング後に十分な量の水で数回（うちらは10 min, ３回）あらった時点で4℃で保存することは時々しています。短い時で一晩、長い時で数日ないし１週間程度置いてます。(ただし1ヶ月以上置いてた時にシグナルがけっこう弱くなったことありますので、長期間の保存は勧めません。) いろいろな抗体でときおりそのようにしてきましたが特に問題起きたことないです。 ブロッキングがあまり長いと抗原抗体反応が減弱してシグナルが弱くなるので、ブロッキングO/Nは避けた方がいいです。 ３）抗A抗体に問題があるのだと思いますので、別ロットに交換してもらうか、信頼できる別のメーカーから購入するのが良いとおもいます。メーカーではロットごとに社内で実験して品質チェックしてるはずですので、もし大きく条件が変わる場合はそのように記載があるはずです。私たちは、ロットがかわっても検出の成否にかかわるほどの条件改変を必要とするような経験はありません。 抗体A抗体はポリクロもしくはエピトープのわかっているモノクロの方がよいと思います。仮にリン酸化部位近傍にエピトープがある場合、リン酸化formと非リン酸化フォームで抗体の反応性に差異が生じて結果を見誤る危険があります。

(無題) 削除/引用 No.11711-5 - 2023/08/17 (木) 20:27:01 - C ウェスタン有識者様かとお見受けしますので、追加でお聞きしてもよろしいでしょうか。 �@リン酸化Aを検出し、同じメンブレンをストリッピング→GAPDHやActinをコントロールとする or リン酸化AとTotalAを別メンブレンで検出する データとしては、どちらが望ましいと思われますか。 �A普段、ウォッシュの時間はどれほど厳密になされていますか。 （今回Bを先にやったので、Aはウォッシュの時間がやや長めでした） 抗体反応時間と比べると、自分はかなりなあなあになってしまっていると感じました。

(無題) 削除/引用 No.11711-4 - 2023/08/17 (木) 19:36:59 - C おお様、ありがとうございます。 > リン酸化、トータルの順にしているけど、シグナルとして弱い方から検出させると、やり易いはずです。そのように考慮した結果の順番ですか？ シグナルの強度は考慮していませんでした。リン酸化の方が発現量が少ないはずなのと、ストリッピングによるダメージを受ける可能性もあると聞いたのでこの順にしていました。 > > ストリッピング後2次抗体だけで反応させバンドが出ない事を確認するべきでは。 なるほど。この場合出ないことを確認後、また2次抗体を落とす用のストリッピングをしますか？

(無題) 削除/引用 No.11711-3 - 2023/08/17 (木) 02:29:32 - おお >ロットを変えると至適な抗体希釈濃度って変わることもあるのでしょうか ロットに関してはメーカーに問い合わせてください。製造過程によっては変わる可能性はあると思いますが、どのように品質管理しているかも要因になると思うので。 ＞�Aリン酸化A検出→ストリッピング→ブロッキング→TotalA一次抗体→Overnightが理想なのですが、スケジュール的に厳しい時があります。 ブロッキングでOver nightで過剰なブロッキングにならないようであればブロッキングで止めればいいです。それがだめならストリッピングのあとです。もちろん検出後すぐにTBSTで保存とかしてもかまわないです。 抗体はリン酸化とトータルで同種ですか、それとも異種ですか？

(無題) 削除/引用 No.11711-2 - 2023/08/16 (水) 17:22:59 - おお めんぶれんを複数用意すれば短縮できます。 >バンドがとても薄いです。 ストリッピングすれば抗体との反応性もよわくなりますが、元々そう言う抗体なのか、ストリッピングのせいなのか判断出来てますか？ また、ストリッピングも弱いものから強いものまであります。以下にも書きますが、シグナルが弱い抗体から検出すると、強いストリッピングをせずに済むので、次に見る抗原の抗体との反応性も比較的維持されます > （リン酸化Aバンドの可能性もアリ） その可能性を完全に否定しておかないとデーターになりません。ストリッピング後2次抗体だけで反応させバンドが出ない事を確認するべきでは。でないと面白いデーターが出ました。でも、トータルのバンドのシグナルが本当かわかりませんってデーター出せますか？ リン酸化、トータルの順にしているけど、シグナルとして弱い方から検出させると、やり易いはずです。そのように考慮した結果の順番ですか？

リン酸化タンパク質のウェスタン 削除/引用 No.11711-1 - 2023/08/16 (水) 15:00:36 - C ウェスタンブロッティングで2種類のリン酸化タンパク質（A、B）の検出を試みています。 �@リン酸化タンパク質A→Total A→別のリン酸化タンパク質B→Total Bの検出をやったことある方いらっしゃいますか？（ブロッキングは全てBSAです） �Aリン酸化A検出→ストリッピング→ブロッキング→TotalA一次抗体→Overnightが理想なのですが、スケジュール的に厳しい時があります。 TBS/Tに付けるとしたらどこで止めるのが良いのでしょうか？ �B（これはリン酸化関係ないかもですが）、リン酸化タンパク質Aの検出後、非リン酸化体（Total A）の検出が上手くいきません。バンドがとても薄いです。（リン酸化Aバンドの可能性もアリ） Bではできているので、Total A抗体を新しくしたせいかと思います。ロットを変えると至適な抗体希釈濃度って変わることもあるのでしょうか、、、この場合濃度を上げて条件検討が良いでしょうか。 変なことを言っていたらすみません。よろしくお願いします。

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