全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11717-10 - 2023/08/21 (月) 16:17:13 - か どうしてグアニジン塩酸でやりたいんですかね。 サンプルを電気泳動用とリフォールディング用に分けてそれぞれウレアとグアニジンで溶かすとか、グアニジンで溶かして透析してから電気泳動するとか、ここで聞かなくてわかりそうなものですが。 せめてHisタグがついていればもっとオプションがあるのですが、情報が少なすぎて。 ちゃんと書かないと的確なコメント来ないですよ。

(無題) 削除/引用 No.11717-9 - 2023/08/20 (日) 11:52:30 - おお https://patents.google.com/patent/EP2865685A1/en グアニジンが入っていてもちゃんと流れるModified SDSPAGEの特許です。

(無題) 削除/引用 No.11717-8 - 2023/08/19 (土) 12:47:49 - G25 > SDS-PAGE上で目的タンパク質のバンドがほぼ単一に見られた場合、洗浄できたと判断して、続くリフォールディングに取り掛かってもよいという形でしょうか。 封入体を洗浄すれば封入体化した強制発現タンパク質が8割くらいには達するというのを何かの本で読んだことがあって、実際そんなもののように感じていました。「ほぼ単一」がどの程度の状態を想定しているのかわかりませんが、いくらやっても限界はあるので過度の期待はしないように。 もちろん洗浄前の封入体も一部サンプルとして取っておいて、洗浄したものと泳動像を比較しながらやるのがいいです。

(無題) 削除/引用 No.11717-7 - 2023/08/19 (土) 12:10:02 - G25 > 洗浄の際にグアニジンあるいは尿素の濃度によっては目的タンパクも変性してしまうので、 変性というか、可溶化ではないですか。封入体化しているタンパク質はめちゃくちゃな折りたたまれ方した「変性」タンパク質ですから今さら変性を気にするものでもない。 洗浄中に可溶化してしまうともはや封入体の沈殿から抜けてしまって、上清と一緒に捨ててしまうことになるので、目的のタンパク質を可溶化せず、なるべく他のタンパク質が上清にとけだすような濃度条件の検討が必要と言っているのだと見ましたが。 洗浄のためにグアニジン塩を使ったとしても上清として取り除かれ、さらに封入体の沈殿を適当なバッファーで洗浄すればよろしい。 最終的にはリフォールディングのため変性剤での可溶化は必要でしょうけど、封入体のチェックのための泳動なら、封入体あるいはその懸濁液の一部を取って、SDS-PAGEサンプルバッファーでボイルしてやれば可溶化してそのままアプライできます。

(無題) 削除/引用 No.11717-6 - 2023/08/19 (土) 09:58:10 - おお ＞グアニジンで実施したい場合、何か方策はありますか？ 透析が生化学的にストレートなやり方ですが、マイクロチューブのふたのところに透析膜がはられたものとか売っていたりするのであまり手間をかけずにできなくはないです。 あるいはゲルろ過スピンカラムとか使えると思います。 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge27532501 この場合尿素を含むバッファーで平衡化しておけば、グアニジンが抜けたためにあぐるのを防ぐことができると思います。

(無題) 削除/引用 No.11717-5 - 2023/08/19 (土) 09:46:37 - おお >[Re:4] 封入体さんは書きました : > ネットで調べると、尿素はグアニジンに比して変性能が低い、かつシアン酸を生じ化学修飾の可能性があるとありますが、これに関してはそこまで懸念したくても良いのでしょうか。 シアン酸を生じ化学修飾の可能性があるというのは加熱した場合おこります。化学修飾に関して室温以下で何日か保存しても修飾されなかったという論文を見たことがあります。 変性能が低いということに関して、尿素はSDSで解離できないたんぱくの相互作用（アグリゲーションをふくむ）を容易に解離、分散、可溶化できます。SDSPAGEで分析できるのであれば、それより強い変性能力があると思えますので十分だと思います。 とはいってもリフォールディングでどちらがいいのかはそのたんぱく次第でしょうから、小スケールでその辺のめぼしをつけておいたほうがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11717-4 - 2023/08/19 (土) 09:17:01 - 封入体 ネットで調べると、尿素はグアニジンに比して変性能が低い、かつシアン酸を生じ化学修飾の可能性があるとありますが、これに関してはそこまで懸念したくても良いのでしょうか。 また、どうしてもグアニジンで実施したい場合、何か方策はありますか？

(無題) 削除/引用 No.11717-3 - 2023/08/18 (金) 00:31:25 - おお 尿素は電荷をもたないので、泳動への影響は大きくありません。あぐりやすいたんぱくはゲルに尿素を入れて泳動することもされています。

(無題) 削除/引用 No.11717-2 - 2023/08/17 (木) 22:00:13 - か 自分の封入体が溶けなければいいので、DOC,TritonX100のどちらでなければならないということではありません。 グアニジン塩酸は電気泳動不可ですが、尿素なら全レーンに同じ量の尿素を入れれば電気泳動可能なので加熱だけ注意すれば尿素の方が扱いやすいです。

封入体の洗浄に関して 削除/引用 No.11717-1 - 2023/08/17 (木) 20:29:52 - 封入体 大腸菌組換えタンパク質発現に形成された封入体の洗浄に関して、市販されているリフォールディングキットのマニュアルを見ると、デオキシコール酸を用いて洗浄を行い、膜タンパク質の除去を行なうように指示していることが多いように感じました。ネットで調べるとTriton X-100を使用している場合も有りますが、特段前者である必要はないという形でしょうか。 また、洗浄の際にグアニジンあるいは尿素の濃度によっては目的タンパクも変性してしまうので、変性剤濃度の最適化を行なう必要もあると思われますが、この際、SDS-PAGEで評価しようとすると変性剤の影響で泳動が乱れそうな気がしておりますが、実際のところいかがでしょうか。また、その場合、どのような対処法をとっておりますか。 そして、SDS-PAGE上で目的タンパク質のバンドがほぼ単一に見られた場合、洗浄できたと判断して、続くリフォールディングに取り掛かってもよいという形でしょうか。 初歩的な質問も多いかとは思いますが、アドバイスいただけると幸いです。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---