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(無題) 削除/引用 No.11720-18 - 2023/08/21 (月) 17:51:42 - うう スレ主さんが、ベクターの切れ残りが無くなるまで切断できて、脱リン酸化もしっかりできれば行けるんでしょう。 自信があればやれば良いと思うけど、制限酵素ごとに効率が違うだろうしシングルコロニー拾ってミニプレップまでやったのにもう一回やり直しになるくらいなら電気泳動とゲル抽出くらいやった方が良いって話でしょうね

(無題) 削除/引用 No.11720-17 - 2023/08/19 (土) 11:47:32 - が ちなみに、脱リン酸化は特殊な理由がない限り、やっていないです。

(無題) 削除/引用 No.11720-16 - 2023/08/19 (土) 11:46:18 - が 他の方と同様に、我々も制限酵素処理後、50bp以下の短い断片を除去する目的でカラム精製のみでLigation等おこなっています。クローニング、普段から無茶苦茶やっていますが、そのステップは問題になっていないです。 あとは、質問者さんの勇気ですかね。

(無題) 削除/引用 No.11720-15 - 2023/08/19 (土) 11:23:54 - LK99 質問を読むと、「カラム精製だけだとかなり楽になるのですが、やっている方はいらっしゃいますか？」とありますので、ゲル切り出した方がいいとかおすすめしませんというのは全く回答になっていませんよね。 私は毎週のように実際にやっていますし、むしろよほど特殊な制限酵素でも使わない限り、ゲル精製はしません。カラム精製で切られたフラグメントが残るかどうかを心配されているようですが、脱リン酸化していれば仮に残っていても問題ありません。 ゲル切り出しを省くと「楽になる」なら一度試すべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.11720-14 - 2023/08/19 (土) 10:57:38 - --- G25さん これは失礼しました。G25さんの手技を批判したつもりはなかったのですが、易しいクローニングで1/20程度の効率、ということを例に挙げておられたので。文字に書くときつい表現に受け取られたかもしれませんね。すみませんでした。

(無題) 削除/引用 No.11720-13 - 2023/08/19 (土) 10:39:25 - G25 私も切り出ししない様々な手法も通用していることを最初から認めたうえで、おすすめはしないと言っているだけであって、切り出ししない派をディスってるわけじゃないんですけど。 いやはや、実際に見たわけでもない人から手技に問題があるとまで言われるとは、

(無題) 削除/引用 No.11720-12 - 2023/08/19 (土) 09:53:50 - --- >だから絶対に大丈夫、とは言いません。 だからといって絶対に大丈夫、とは言いません。 Typo失礼

(無題) 削除/引用 No.11720-11 - 2023/08/19 (土) 09:51:46 - --- > 易しいクローニングで、少々非組換え体バックグラウンドが高くても、10個か20個拾って一個あたりが取れればいいや、くらいの実験ならゲル切り出し精製しなくてもいいかもしれませんが、 まぁそんなに効率が悪いならそもそも手技に問題ありますけどね。 ゲル切り出ししないでクローニング、は数回程度しか経験がないですが、ほぼ普段通りの効率でした、私の場合は（例えば、10個拾って8-9個当たり）。だから絶対に大丈夫、とは言いません。 厳密に進めるべき、という意見もわかりますし基本はそのスタンスで良いと思いますけど（学生が相談なしに勝手にそういうやり方をしてたら注意しますよ）、ラボによって色々事情もありますからね。ポスドク以上ならある程度自分の裁量で試薬や労力の節約を試す経験はしても良いと思います。個人的な意見ですけど。

(無題) 削除/引用 No.11720-10 - 2023/08/19 (土) 08:38:12 - G25 部分変性プラスミドがどのくらい混入しているかは、preparation ごと、あるいは精製の手によって様々なので、いつでも配慮が不必要、あるいは必要とは限りませんけど。運良くこれまでずっといい精製品に当たり続けていれば、経験ないでしょうけど。 オバケの出やすさはプラスミド精製キットによっても違ったりするようです。

(無題) 削除/引用 No.11720-8 - 2023/08/19 (土) 07:03:38 - Anode ちなみにG25さんが心配されているバックグランドもほとんどないです(脱リン酸化は必須)。心配であれば、インサートなしのコントロールもやれば大丈夫です。 コロニー数は1:10くらいの比率で出るし、ほとんどの場合2個拾ったら両方インサートが入っています。

(無題) 削除/引用 No.11720-7 - 2023/08/19 (土) 06:59:38 - Anode 私は脱リン酸はしてますが、いつもカラム精製だけで全く問題ありません。

(無題) 削除/引用 No.11720-6 - 2023/08/18 (金) 19:04:14 - G25 結論から言うと、そういう方法では制限酵素耐性で切れ残ったプラスミドが除去されず、高い非組換え体のバックグラウンドを生じる原因になるので、おすすめしません。 あなたが想定しているカラムの使用と同じ目的でフェノール抽出とEtOH沈殿、あるいはEtOH沈殿だけ（EtOHで失活する酵素の場合）、あるいは熱失活（熱失活する酵素の場合）だけという方法もありますから、その意味ではカラム精製は十分OKです。 しかし、精製プラスミドのなかには制限酵素耐性の分子が多かれ少なかれ混じっているもので、上記の方法ではそれが持ち込まれてしまいます。 制限酵素耐性となるのは精製の過程でアルカリ処理されたときに部分変性して、二重鎖に歪みが生じるためです。部分変性したプラスミドはアルカリ処理が過剰で大量に生じた場合や、そうでなくても大量に泳動したときにcccより少しだけ移動の早いバンドとして見えるので、俗にghost bandとかghost plasmidと呼ばれます。 ghost plasmidは電気泳動でチェックしたぐらいでは見えないほど微量だとしても、環状を保ったプラスミドで形質転換効率は高いですから、非組換え体のコロニーが多数出現する可能性が高いです。バックグランドを減らそうといくら一生懸命に脱リン酸処理をしても効きません。例えば泳動で検出できる限界の1/1000として1 pgの環状プラスミドが混じっているとしても、並のコンピーテントセルなら３桁くらいのコロニーを生じえます。 易しいクローニングで、少々非組換え体バックグラウンドが高くても、10個か20個拾って一個あたりが取れればいいや、くらいの実験ならゲル切り出し精製しなくてもいいかもしれませんが、難度高めのコンストラクションだと、非組換え体ばかり生えてあたりがとれないということになりかねません。

(無題) 削除/引用 No.11720-5 - 2023/08/18 (金) 18:54:56 - 774R 原理的には可能だけど、自分が扱うベクターの長さが合ってるかとか、デザイン通りに切れているかとか、電気泳動で確認したいですよね。どうせ泳動するならゲル切り出しもやっちゃうね。自分なら。

(無題) 削除/引用 No.11720-4 - 2023/08/18 (金) 17:22:37 - --- インサートを多めにしてライゲーションすれば大丈夫と思いますよ。 single cutのベクターを使う際も脱リン酸化処理をせずとも十分な効率でクローニング出来るわけですし。 クローニングしにくい配列だったりインサートが長い場合は当たりクローンを得にくいかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.11720-3 - 2023/08/18 (金) 17:13:51 - column おおさん有難うございます。 こんな便利なものが販売されているのですね。

(無題) 削除/引用 No.11720-2 - 2023/08/18 (金) 16:50:19 - おお https://www.mn-net.com/us/nucleospin-gel-and-pcr-clean-up-mini-kit-for-gel-extraction-and-pcr-clean-up-740609.50?c=5291 これですかね。 Fragment size50 bp−approx. 20 kbp て書いてますけどね。 50以下は全く混じらない保証はないですけど。 サイズで分けるならゲル濾過のスピンカラムの方が確実ではある。 https://www.takarabio.com/products/mrna-and-cdna-synthesis/mrna-and-cdna-synthesis-accessories/nucleic-acid-purification-and-fractionation?catalog=636055

制限酵素処理後、ゲル抽出ではなく、カラム抽出のみの方 削除/引用 No.11720-1 - 2023/08/18 (金) 16:24:07 - column クローニングのためにプラスミドを制限酵素処理し、インサートを組み込むというお馴染みの作業をしてます。 当該プラスミドを2種類の制限酵素で処理しますと、40bpの切れ端がでてきます。ベクター側は6000bpです。 いつも電気泳動、ゲル抽出の流れだったのですが、 カラム精製だけでもいけますか？ 例えばNucleoSpin® Gel and PCR Clean-up というDNA精製カラムのプロトコル9ページを見ると、 binding bufferの量を調節すると小さいフラグメントはカラムに吸着しないと書いてあります。 カラム精製だけだとかなり楽になるのですが、やっている方はいらっしゃいますか？

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