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(無題) 削除/引用 No.11726-6 - 2023/08/22 (火) 17:23:47 - おお RecAに変異がないやつを見つけるのがむずかしいんけどDH5alphaも遺伝子型はRecA1だし。

(無題) 削除/引用 No.11726-5 - 2023/08/22 (火) 17:22:46 - もやしもん すみません、逆でしたね。BL21はRecAが生き残っている方でした。

(無題) 削除/引用 No.11726-4 - 2023/08/22 (火) 17:15:59 - もやしもん かん様、おお様 ご回答いただき感謝いたします。 経験者のご意見は大変有難いです。 STBLはやはり効率は落ちるのですね。 一方で、かなりラージスケールのライブラリーを作製したいと考えております。 ＞recA(-)の高効率ライブラリー作製用コンピテントセルを使ってみてはどうですか。 こちらは具体的にはどのコンピテントセルを使用されましたか？ 「製品選択ガイド（コンピテントセル・エレクトロセル）」でググると出てくるTakaraのまとめではBL21等がでてきました。

(無題) 削除/引用 No.11726-3 - 2023/08/22 (火) 11:10:34 - かん どのくらいのダイバーシティを維持したいかによりますが、レンチ用のベクターはサイズが大きいのとSTBL4はエレクトロポレーション用でも効率は高くないので、多少の組み換えが起こることは目をつぶって、recA(-)の高効率ライブラリー作製用コンピテントセルを使ってみてはどうですか。 私もレンチベクターで変な組み換えが起こってしまった際にSTBLで解決したことはありますが、ダイバーシティを維持したライブラリー用には導入効率が不十分だと思いました。 余裕があれば、いくつかのrecA(-)高効率大腸菌株で試しにトランスフェクションしてコロニーPCRを数十個くらいずつ試し、異常な組み換えが起こっている割合を出してどれでライブラリーを作るか決めてもいいと思います。 インディペンデントクローン数の小さいライブラリーならSTBLで頑張ってもいいかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.11726-2 - 2023/08/22 (火) 03:26:17 - おお ＞（ライゲーション効率等の議論は無しでお願いします） ここは大変重要なところと思いますが、それでもあえて無しということなのですね。。。もしレンチ用のインタクトのベクターの効率が悪いわけではないなら、レンチなどの繰り返し配列をもつベクターに対して問題がない大腸菌だと思いますが。 各社レトロやレンチなど繰り返し配列をもつベクターに対応した大腸菌は売っているようですが、 たとえば、 Takara：　Stellar Competent Cells are an E. coli （HST08 strain） NEB：　NEB Stable Competent リコンビネーションを低減するためにRecAなどに変異を入れたものが推奨されています。RecAではなく、RecJなどをいじったSure,Sure2なども使われたりすることがあるようですね。 ただ、RecAに変異が入った株はDH5alphaなども含みますので（DH5alphaでも使えたりもする場合がありますが）、その他の変異の組み合わせもあるのだろうなと思いますが、、、

レンチウイルスプラスミド用の良いコンピテントセル 削除/引用 No.11726-1 - 2023/08/21 (月) 20:05:45 - もやしもん いつも勉強させて頂いております。 レンチウイルスプラスミドを用いて プラスミドライブラリーの構築に取り組んでいます。 これまで、ライブラリーDNAをプラスミドにライゲーション後、 ElectroMAX STBL4をトランスフォーメーションに用いていたのですが、 あまりコロニーが生えてきません。 他にレンチウイルスプラスミド用のおすすめのコンピテントセルはありますか？ （ライゲーション効率等の議論は無しでお願いします） また、STBL4を増やして、自作のエレポ用コンピを作ると、コンピテンシーが市販のものと比べて異常に落ちるのですが、このような自作は難しいのでしょうか。

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