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(無題) 削除/引用 No.11782-5 - 2023/09/27 (水) 10:54:28 - Kras 陰性と言われる中にも、侵入に失敗したり、細胞に侵入したけどゲノムに組み込まれなかったり、ゲノムに組み込まれたけど不活化されたり、と可能性としては色々です。 蛍光タンパク質発現が目的の場合には、その全てが上手くいったものをpoitiveとするのが実用的には便利なので、おおさんと同じく101以上をあくまでも陽性としています。FCMの蛍光検出感度は結構高いですし。 ただ目的によって方法は異なり、感染細胞のゲノムに挿入されたウイルスコピー数をqPCR測定することもあります。先人は色々やっているもので測定方法間の比較論文もありますし、これについては自身の目的に応じた測定法を採用するのが一番です。 それで、FCMで見るところのいわゆる陰性集団が非感染集団と比較して感染集団でシフトするのは確かに見ますね。ウイルス液中の夾雑物か発現には至らないレベルの感染に対して反応性に細胞膜の状態が変化し、一過性にバックグラウンドが変わったのかなあと私は思っていました、特に根拠はありませんが。

(無題) 削除/引用 No.11782-4 - 2023/09/17 (日) 08:19:12 - おお その説明はできたとしても、50-100に感染してない細胞がいる可能性をどう否定するかです。ですからその方法における限界とも言えるし、目的によっては、そのレベルの発現を感染した細胞は感染細胞として余り意味がないと言う判断もあり得ます。 そのやり方ではダメだと言うなら違う方法を見つけるか樹立するべきです。

(無題) 削除/引用 No.11782-3 - 2023/09/16 (土) 13:05:46 - うほほ 10-50のcell populationがほぼ消滅しているのはどう説明をしたらいいのでしょうか？元の細胞集団の自家蛍光には幅があると考えることは全くおかしいことだとは思いません。 さらには、細胞種を変えても同様の現象が見られます。

(無題) 削除/引用 No.11782-2 - 2023/09/16 (土) 12:03:35 - おお ＞元々10-50だったものが、50-100に移行していたとすれば、それも感染していると評価していいと思う 私は思わないです。「コントロールの細胞では、蛍光の99%が10-100に収まる」ならば５０が９０になったとしても、蛍光のシグナルではなくノイズでしかないと思えるからです。

レンチウイルスよる遺伝子発現の効率の定量化 削除/引用 No.11782-1 - 2023/09/16 (土) 10:26:49 - うほほ レンチウイルスを使って、遺伝子を強制発現させています。 発現効率の定量を行っているのですが、gatingでの評価が正しいのか、疑問が沸きます。 具体的には、コントロールの細胞では、蛍光の99%が10-100に収まるため、101以上にgatingをかけて、遺伝子を強制発現させた細胞での評価を行ったところ、35%と出ました。 しかしながら、実際に分布をみると、10-50までがほぼ消失しているのですが、正確に感染効率を定量しようとするとどういう指標を用いるのがいいのでしょうか。元々10-50だったものが、50-100に移行していたとすれば、それも感染していると評価していいと思うのですが、多くの論文は、上記の101以上のような評価を行っています。 みなさん評価方法はどのようにしていますか。もちろん感染効率を知りたいのか、一定の蛍光強度以上の数値を比較したいのか、等考え方で違うはずですが。

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