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(無題) 削除/引用 No.11832-33 - 2023/10/21 (土) 21:22:26 - あの 詳しい人に御意見うかがいたいのですが、スレ主さんの環境でスレ主さんの目的達成のために、イオン交換を使うとしたら、カラム法よりも、バッチ法の方が良いのではないかと思ったのですが、どうなんでしょう？。

(無題) 削除/引用 No.11832-32 - 2023/10/21 (土) 02:16:26 - おお >これらなしでカラムワークはちょっと難しいとおもいます。 ステップワイズである程度細かく濃度を上げていけばそこまで変になることはないと思いますけどねぇ、、、 ＞全フラクションもしくは（数が多ければ）１つおきくらいのフラクションでウェスタンしてください。 すでに精製済み（純度はわかりませんが）のものでありますしUV吸収であたりをつければ全フラクションWBするほど手間をかける必要があるのかなと思いますけど。もちろんUVの吸収が複雑なプロファイルになればSDSPAGEとかやることになるとは思いますが、リコンビナントで精製しているものなので量的に十分であればCBB染色でもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11832-31 - 2023/10/20 (金) 21:27:50 - ち ゲル濾過は簡単で、吸着ロスも少ないので便利ですが、分離はブロードで、濃縮効果が期待できないので、もともと量的にすくないと希釈されてしまいうまく検出できないかもしれません。また１００KDaとか４０KDaと言ってるのはあくまでSDS-PAGEでの話ですので、ゲル濾過でそれに相当する分子量付近に出てくるかどうかもわかりません。未変性ですので、多量体を形成するかもしれませんし、担体との予期せぬ相互作用でとんでも無いところに出てきたりすることもあります。 分離がまあまあシャープで濃縮効果も期待できるイオン交換のほうが良いとおもいます。 全フラクションもしくは（数が多ければ）１つおきくらいのフラクションでウェスタンしてください。 HPLCもしくはFPLCでおこなうのがよいのですがなければ、オープンカラムでやることになります。フラクションコレクターはありますか。またイオン交換ならばグラジェントメーカーはありますか。これらなしでカラムワークはちょっと難しいとおもいます。とくにこうした分析に慣れた人がいないと、しなくていい苦労をして時間を大幅にロスすることにもなります。 こういった分析機器は都道府県の公的試験研究機関(あるいは民間分析機器メーカーでも）で時間あたりの有料で使わせてくれるとこもあるとおもいますので、相談されてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11832-30 - 2023/10/20 (金) 01:35:26 - おお カルシウムが入っていることはそんなに気にならないです。実際カルシウムを抽出時に使ったサンプルが乗せられることもあるようですし。平衡化する際にも入っていてもいいと思います。気になるならなるべく濃度を下げればいいかもしれません。0.5とか0.25ｍMとか

(無題) 削除/引用 No.11832-29 - 2023/10/19 (木) 23:40:58 - Y おお先生、 明日、いよいよイオン交換（QAE）を行います。 これまでの流れをおさらいさせていただきますと、 とあるタンパク質を培地から精製し、Pressision proteaseでそれを切断すると100と45 kDaに分離されます。 現在、protease処理中です。 明日、45 kDaのものを100 kDaの不要なものから精製するためにQAEを使います。 ２つ確認させていただきたいのですが、45 kDaのタンパク質はCaを構造の安定化のために必要としています。そこでこれまでに全てのステップで1 mM CaCl2を加えてprotease処理等しています。 明日、この切断サンプルをQAEに供する際に、1 mM CaCl2をサンプル（in 10 mM Tris-HCl, pH8）に喰えていても問題ありませんでしょうか？おそらく、1 mM程度なら影響ないだろうとは思っていますが、、 もう一つは、1 mM CaCl2を加えるのなら、やはりQAEの平衡化も10 mM Tris-HCl, pH8, 1 mM CaCl2で行うべきですよね？ すみません、確認させていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.11832-28 - 2023/10/14 (土) 15:11:56 - Y おお先生 ありがとうございます。 具体的な精製手順が想像できるようになりました。 保存方法につきましても、ありがとうございます。 では初めに培養上清（Opti-MEM1ベース）に分泌させたHisタグタンパク質をNi-NTAビーズに結合させ、imidazoleで溶出後、buffer置換後に濃縮、Pressision proteaseで切断します。ここで得られた100 kDa（除きたい方）と45 kDa（必要な方）を分離させるため、10 mM Tris, pH8（塩フリー）で十分に希釈後、QAE-A25に供したいと思います。 また質問してしまうかもしれませんが、どうかよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.11832-27 - 2023/10/12 (木) 16:43:33 - おお >[Re:26] Yさんは書きました : > > まず、50 mM Tris-HCl, pH8でQAE-A25を平衡化、膨潤化させます。 > みずでもいいぐらいです。膨潤の後はカラムに詰めた際に平衡化バッファーで洗ってください。TRISはよほど強いバッファー効果が必要でない場合(lysisしただけでクルードなものとか、からむにかけるまえの処理の時のバッファー持ち込みとかなら必要かも)、10mMもあれば十分です。バッファーイオン状態のものは塩として働きますから、つくかつかないかびみょうなタンパクではバッファー濃度も低い方が付きやすくなりますから。5mでやっているものもたまに見かけます。 > その間に、Pressision Protease処理したものをアミコンチューブにかけ、50 mM Tris-HCl, pH8にbuffer置換します。 どうせカラムに流したらつくから、塩濃度が十分低くなるように平衡化バッファーで薄める(10倍とか)人もいます。ただつくかつかないか、つく条件など分かってないことを考えると、アミコンとか透析とかがいいかもしれません。それから最初に小スケールで探るか。 > > 1. その後、25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 mM NaClで段階的に溶出を行い、各分画のCBB染色を行う、という理解でいいでしょうか？ > そんなもんでしょうね。塩濃度は1Mまであげた方がいいです。500mMでも溶出しないタンパクも結構あるし。次回使用する時のために、完全に吸着したものを取るという意味でも。溶出する濃度がわかっていればもっと単純化や分離のためのデザインも可能ですが。 > > 3. 膨潤化したQAE-A25は用事調製でしょうか？それとも４度に保存していればかなりの日数、問題ありませんでしょうか？ 4度で問題ありません。バクテリアとか生えない限りは半永久的と思ってもいいと思う。長期保存の場合は10％程度のアルコールを加えたバッファーなどで菌が増殖しないようにしたりもします。

(無題) 削除/引用 No.11832-26 - 2023/10/12 (木) 15:20:13 - Y トピ立てしたものです。 QAE-A25が届きましたので、早速挑戦してみようと思います。 私の理解が間違っていたらご指摘いただけますと幸いです。３つほど質問があります。 まず、50 mM Tris-HCl, pH8でQAE-A25を平衡化、膨潤化させます。 その間に、Pressision Protease処理したものをアミコンチューブにかけ、50 mM Tris-HCl, pH8にbuffer置換します。 その後、QAE-A-25を適当な大きさのカラムに充填し、そこへbuffer置換したタンパク質溶液（100 kDと45 kDaの混ざり物）を加えます。 1. その後、25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 mM NaClで段階的に溶出を行い、各分画のCBB染色を行う、という理解でいいでしょうか？ 2. もう少し小刻みで塩濃度を振った方がいいでしょうか？ 3. 膨潤化したQAE-A25は用事調製でしょうか？それとも４度に保存していればかなりの日数、問題ありませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11832-25 - 2023/10/08 (日) 23:59:18 - Y おお先生 ありがとうございます。 Ni精製を次回行う際に、PVPブロックを覚えておくようにします。 今回、protease処理後に出来た100 kDaと45 kDaの分離ですが、100kDaのcutoff値のアミコンチューブなら、ひょっとしたらpass through分画に45 　kDaが来るような気がして来ました。それならイオン交換やゲル濾過必要なく45 kDaを回収できそうです。

(無題) 削除/引用 No.11832-24 - 2023/10/08 (日) 17:01:19 - おお >[Re:23] Yさんは書きました : > おお先生 > > >因みにNi ビーズでは、BSAを吸着するのでPVPでブロッキングする > > これは私も過去のトピックで拝見いたしました。 > 実はGSTタグの前に、His6で挑戦しており、培地はOpti-MEM1を用いているにも関わらず、覗ききれていなかったFBS由来のBSAがNi-NTAに結合してしまい、回収率が落ちてしまったと考え、GSTタグに変えた経緯があります。 正確に書き切れてなく誤解があるといけないので、、、 NiビーズへのBSAの吸着はどうやらニッケルとの錯体形成によるものかと思われます。ある意味スペシフィック？ただノンスペを防ぐためにビーズをBSAで処理しておくという話が広まったせいか、Niビーズでもそれがいいと思っている人も見かけます。ですからブロッキングにBSAをつかうかわりにPVPを使うという話があるということです。念のため。

(無題) 削除/引用 No.11832-23 - 2023/10/08 (日) 16:49:06 - Y おお先生 引き続きありがとうございます。 > ゲル濾過のカラムは乗せる容量の20倍程度でゲルの分解能が十分発揮できるという目安がありますが、クルードなサンプルならそれぐらいしたほうがいいでしょうけど、10倍でもそこそこわかれます。ゲル濾過の場合はフラクションは、乗せた容量の2から3分の1で良いでしょう。原理的に載せた容量を保って移動すると思っていいので。 ご経験に基づくアドバイス、本当に貴重だと思っています。 ありがとうございます。 >因みにNi ビーズでは、BSAを吸着するのでPVPでブロッキングする これは私も過去のトピックで拝見いたしました。 実はGSTタグの前に、His6で挑戦しており、培地はOpti-MEM1を用いているにも関わらず、覗ききれていなかったFBS由来のBSAがNi-NTAに結合してしまい、回収率が落ちてしまったと考え、GSTタグに変えた経緯があります。

(無題) 削除/引用 No.11832-22 - 2023/10/08 (日) 15:54:27 - Y あの様 ゲル濾過を説明してくださり、ありがとうございました。 具体的に頭の中でイメージすることができました。 リアルタイムでOD280をモニターすることはできませんが、各分画の吸光度を測定することは可能ですので、ゲル濾過を行う場合にはお示しいただいた方法を習ってトライしてみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11832-21 - 2023/10/08 (日) 15:48:30 - Y が様 ありがとうございます。 > 限外ろ過のcut-off値は全くアテにならないと思っていいです。 私もそのような印象を持っています。 グルタチオンビーズで精製後にproteaseで切断し、100と45 kDaの分離を100 kDa cut offで行えばひょっとしたらうまくいくかもしれないと思えてきました。

(無題) 削除/引用 No.11832-20 - 2023/10/08 (日) 08:02:50 - あの もしできるだけ、余計なタンパクを混入させたくない場合には、次の２点 タンパク等でカラムをブロッキングした後に、よく洗い流す。プレパックカラムだと洗いすぎると、流速が落ちるけど、自作なら詰め直せば良いと思う。 分画をとるチューブは、低吸着グレードのものを使い、バッファにはBSA等を入れない。ただし酸化防止等の対策は適否　考える。 カラム段階より前の段階の情報も、後の段階の使用目的も不明なので、御自身で適宜、御判断を。

(無題) 削除/引用 No.11832-19 - 2023/10/08 (日) 04:20:36 - おお ゲル濾過でBSAはわかるけど、私は付けたくない派ですね。BSAが吸着しているというのはゲル濾過のゲルがBSAで塞がれているという事なので分離能に不安が残ります。 因みにNi ビーズでは、BSAを吸着するのでPVPでブロッキングするというの をみた事がある。

(無題) 削除/引用 No.11832-18 - 2023/10/08 (日) 04:11:59 - おお ゲル濾過のカラムは乗せる容量の20倍程度でゲルの分解能が十分発揮できるという目安がありますが、クルードなサンプルならそれぐらいしたほうがいいでしょうけど、10倍でもそこそこわかれます。ゲル濾過の場合はフラクションは、乗せた容量の2から3分の1で良いでしょう。原理的に載せた容量を保って移動すると思っていいので。

(無題) 削除/引用 No.11832-17 - 2023/10/08 (日) 04:00:08 - おお >[Re:7] Yさんは書きました : > おお様 > > QAEを使った陰イオン交換を少しだけ行ったことがありますが、陰イオン交換の担体として、QAEとDEAEがあった場合、何も情報がないタンパク質の時にはまずはQAEだと昔聞いたことがあります。 > またQAEにも25と50があります。 > > 質問に質問を重ねて恐縮ですが、以下２点につきコメントをいただけませんでしょうか。 > > 1. 陰イオン交換樹脂として、QAEでまずは行ってみるべきでしょうか？ > 2. 25と50の場合、どちらが今回はおすすめでしょうか？ > > 大変恐縮ですが、ご意見伺えますと幸いです。 手元にあってすぐ取り掛かれる状態なら、そうすればいいと思います。QAE の方が吸着力が強く素通りするタンパクが少ないと言う意味では無難です。DEAE でも大抵着くと思いますけど。 25と50 この点はよく分からないのだけど、G25、50がベースという事なんでしょうか。どちらでも良さそうですが。

(無題) 削除/引用 No.11832-16 - 2023/10/08 (日) 03:49:53 - あの 補足ですが、手作業での分子量に基づくカラム分離法では、55kDa(=100-45)を、45kDaから分けるのは、相当に難しいだろうなと思います。

(無題) 削除/引用 No.11832-15 - 2023/10/07 (土) 20:50:13 - あの 当方は使ったことがありませんが、濃度を下げたく無い場合、次のようシステムが良いかも バイオラッドのロトフォア 　https://www.bio-rad.com/ja-jp/product/microrotofor-cell?ID=b30915de-43cb-4b45-ac11-8067e592c8c0

(無題) 削除/引用 No.11832-14 - 2023/10/07 (土) 20:39:40 - あの 文字化けしましたが、次のNAP5です https://www.cytivalifesciences.co.jp/catalog/0541.html

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