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Stable作製の際の株選択 トピック削除
No.11848-TOPIC - 2023/10/13 (金) 14:59:20 - APC
レンチウイルスであるタンパク質を強制発現させています。
GFPが別のプロモーター下に組み込まれているのですが、基本的には、GFPの蛍光が高ければ、目的のタンパク質も比例して発現量が高いのでしょうか。

stableを選択する際は、どの程度の蛍光のレベルの株を選択するべきなのでしょうか。

逆に発現量が高いものは選択しない方がいいのでしょうか。
 
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No.11848-6 - 2023/10/17 (火) 12:46:16 - CH
1クローンは怖いですね・・・レスキュー細胞とセットならまだ多少ましですが・・

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No.11848-5 - 2023/10/15 (日) 03:16:59 - おお
3つぐらいクローンを拾うと言いましたが、他の実験で目的の遺伝子の発現の結果起こっている事が示せるならば、1つという選択肢はあり得ます。

(無題) 削除/引用
No.11848-4 - 2023/10/14 (土) 01:24:47 - おお
GFPとの相関は大体あるといっておきます。ただ絶対あるとは言い切れないと思います。

>stableを選択する際は、どの程度の蛍光のレベル

目的によるような気がしますので、何とも言えないと思います。全体的に見て中程度であればそのポピュレーションの平均的なものと思えますが、、、そうともいうのが難しいこともあって(後で触れます)。

中程度のものから3クローンぐらい、高発現のものを3クローンぐらい取るというのがベターなのかもしれません。うまくいけば発現量とみている現象との相関が取れるかもしれません。

3つぐらい拾うというのは細胞株の細胞集団はお互い似て非なる(かもしれない、ヘテロな集団)ものだから、たまたま拾ったクローンが何か逸脱した性質を持っていたら、結果がひずんだものになるからです。これが後で触れますといったことです。低発現、中発現、高発現をとると9個クローンを拾うのかという話になってまう。

平均的な発現量のものを拾うなら、クローンを拾わず、全体をプールしてそれで見た方が楽は楽です。あるいは一つ二つ拾ってプールしたものと比較して同様の反応があることを確認するか(でもそれだったらクローン拾わわなくてよくねってなるかもですが)。何らかの確認ができれば一つでもいいとも言えます。

(無題) 削除/引用
No.11848-3 - 2023/10/13 (金) 21:22:16 - えdrftgyふ
相互作用をしらべたり、強発現させた分子が不特定多数の基質に働きかけるようなものの場合は、あまり強発現している株は注意深く避けたほうがいいです。普段は相互作用しないような分子と結合したり、普通なら基質として選ばないような分子に働いたりすることがあるので、あたかもそれらしくみえるが実は人工的な結果を本物と誤認して追いかけてしまうリスクがあるので。。基本的には比較的やや低め、中くらい、比較的高めの3種のクローンを拾って使ってみて実験でどれがいいか判断するのがのが良いと思います。発現低くても、収量的にはまあ許容できるならば、そちらのクローンほうが確実と思います。

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No.11848-2 - 2023/10/13 (金) 18:43:56 - あああ
私が似たようなことをした時は概ね相関がありましたが、常に一致するわけではありませんでした。
そのたんぱくの抗体かタグ付きなら、FACSで発現確認と選択することも可能と思います。


発現量は目的次第なので、自分で決めるべきでしょう。dimを取る人もいるし、hiを取る人もいます。

Stable作製の際の株選択 削除/引用
No.11848-1 - 2023/10/13 (金) 14:59:20 - APC
レンチウイルスであるタンパク質を強制発現させています。
GFPが別のプロモーター下に組み込まれているのですが、基本的には、GFPの蛍光が高ければ、目的のタンパク質も比例して発現量が高いのでしょうか。

stableを選択する際は、どの程度の蛍光のレベルの株を選択するべきなのでしょうか。

逆に発現量が高いものは選択しない方がいいのでしょうか。

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