BioTechnicalフォーラム [遺伝子導入の結果をどう解釈するか。]

遺伝子導入の結果をどう解釈するか。

No.11877-TOPIC - 2023/10/26 (木) 10:31:17 - Monkey

遺伝子導入を行って、細胞形態を見ているのですが、結果が非常に不安定です。
具体的には、

1アミノ酸を導入した遺伝子と導入していない遺伝子を導入して、細胞形態に関して違いを見たいと考えていますが、解釈に難渋しています。

これまでに膨大なトライアルを行い、ばらつきはあるのですが、大まかな傾向として、day4前後では、AA changeありは、+の結果で、なしは、-の結果なのですが、day 8くらいになると -と+に逆転します。

みなさんこういう結果が出た場合、どうしていますか。はっきり言ってどちらにも解釈できる気がします。私の結果がフィードバックなのかどうかわかりません。

合理的な説明がいくまで、いくらでも時間をかけて実験を行っているのでしょうか。本質に見えて、本質でない気がしていますし、レビューアーにこのデータを提示したら、リジェクトされることも多くなる気がします。

例えばメンデルの法則で、連鎖を隠したように、本質の部分だけを自分で解釈して、論文にまとめるのがいいのでしょうか。
　

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(無題)

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No.11877-8 - 2023/10/27 (金) 01:22:57 - Monkey

TransientもStableも両方試しています。

基本的には、Transientは、day4-5までの評価
Stableはday4-5もday8も評価です。3weekの評価等の長期は評価していませんが。

トライアルをたくさんしたというのは、lentiによるStableが主です。lentiのほうがIRESの蛍光が均一な印象ですので。

IRESでつないでいますので、蛍光positiveのものだけ解析しています。

(無題)

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No.11877-7 - 2023/10/26 (木) 20:26:51 - RTYUI

遺伝子導入はtransient ですか、stable ですか。
遺伝子導入にあたり内在性の対応遺伝子はそのままですか、KOしてますか。
もしtransient ならば、day 0からday8までの間での、導入した遺伝子のタンパク質発現レベルの変化はwesternでみていますか。

導入した遺伝子の発現レベルはおそらくday4とday8で同じではないようにおもいます。一般的な話として導入してからday8まで発現が高いレベルで維持されるというのはあまりないような気がします。この辺はウェスタンで確認してください。また導入効率がそれほど高くなければ、細胞増殖にともない、発現細胞と非発現細胞の比率もかなり変わってくるようにおもいます。これについては細胞の蛍光抗体染色で確認してみてください。day4とday8では導入遺伝子の発現レベルの点でも、個々の細胞の発現の有無から見た細胞集団の構成も別物とおもわれますので、結果が異なるのは、まあそういうことも十分予想されることだろうなという気がします。
この種の実験では、すくなくとも予備実験で、導入した遺伝子のタンパク質レベル（ここ大事）での発現がピークになる時期をあらかじめ把握してその時点で実験されることを勧めます。そこから外れた時点でデータ取ってもそのアミノ酸置換の生物学的な意味を正しく評価できないような気がします。

(無題)

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No.11877-6 - 2023/10/26 (木) 15:20:37 - G25

transient transfectionですよね、
宿主細胞でも内在的に発現している遺伝子ですか。
なにを狙ったアミノ酸置換ですか (GOF, LOF, DN etc.)
ベクター、mRNA、タンパク質の減衰速度、寿命はwtと置換体で同じだろうか。
宿主細胞でも内在的に発現している遺伝子ですか。
分裂周期はどれくらいで、wt とアミノ酸置換でも変わらない？

実験結果は解釈を挟まない事実であり、ありのまま記載すべきでが、
一部を隠すということは恣意的に解釈を加えてるわけです。

合理的説明ができるまで、事実(追加実験結果)を積み重ねるのが困難なら、
今知りうる限りの事実は事実として記載して、考察として解釈を試みるのがいいと思います。
過去の知見などから頭捻ってspeculationでいいからいくつかの可能性をあげられないか

綺麗事かもしれませんけど

(無題)

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No.11877-5 - 2023/10/26 (木) 14:01:53 - あああ

day4で、AA changeありは+、なしは-
day 8で -と+に逆転

することを統計的に示して、実験前の仮説に対する科学的な解釈を加えれば良いです。

細胞種、形態、タンパク質機能が全くわからないので、仮説と解釈はここで聞いても答えが出ません。

(無題)

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No.11877-4 - 2023/10/26 (木) 11:43:25 - ああ

細胞相手なので難しいところですが統計がとれるほど実験した結果であればそういう結果として解釈し、その仮説に対する別実験を行いますね

あくまで想像ですが、アミノ酸挿入によるフレームシフトによって発現した変異タンパクがその系で促進/抑制を誘導し形態変化を早めた、と仮定して
・Day１２など更に伸ばして観察する、
・その細胞形態に関与する遺伝子群の発現量（qPCR）をみる
などの実験を行うといった感じでしょううか…

(無題)

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No.11877-3 - 2023/10/26 (木) 11:23:18 - おお

>[Re:1] Monkeyさんは書きました :
> 遺伝子導入を行って、細胞形態を見ているのですが、結果が非常に不安定で
> これまでに膨大なトライアルを行い、ばらつきはあるのですが、大まかな傾向として、day4前後では、AA changeありは、+の結果で、なしは、-の結果なのですが、day 8くらいになると -と+に逆転します。
>

> 合理的な説明がいくまで、いくらでも時間をかけて実験を行っているのでしょうか。本質に見えて、本質でない気がしていますし、レビューアーにこのデータを提示したら、リジェクトされることも多くなる気がします。

ケースバイケースだと思うので、答えることは難しいです。まず科学的データーはDescriptiveであることがベストだと思っています。Day4、Day8のデーター両方示したうえで、それに関して無理のない考察があれば立派な科学的な報告です（考察や結果解釈が無理やりであればリジェクトされるでしょうけど）。Day８で逆転する理由が今後説明がつく可能性もあり、それが何らかの大発見であったりする可能性もあるのだから、おかしいからはしよるとか言うのは科学的な進歩を阻害しているようなものです。少なくともフィードバックかわかりませんっていうけど、それを確かめるのもやり方ですし。

その前に膨大なデーターといいますが、それでやっと傾向が出るのですか？おなじ細胞株を使ってですか？それならちょっと実験系があまりよくないのではと思ってしまいます。それなら実験を組みなおすところからということになる。あと+の結果と言いますが、どれほど顕著な結果なんでしょうかねぇ。。。

>
> 例えばメンデルの法則で、連鎖を隠したように、本質の部分だけを自分で解釈して、論文にまとめるのがいいのでしょうか。

その前にあなたのっ実験の結果において本質の部分が見抜けていますでしょうか？メンデルの件は連鎖という前に、実際に遺伝した形質カウントした数字が出てますからねぇ。ほんとに隠して発表したんでしょうか？事実関係を示すものがあるのでしょうか？

また、導入実験だけではなく、いろいろな角度からの実験で総合的に見ることが本質見えてくることがたいていだからその辺も考えて複数の実験をデザインしていくものだと思いますが、導入実験だけで論文にしようとしているのでしょうか？

あと導入後Transientならひがたつにつれて発現が低下してくると思うのですが、どうなんでしょう。プライマリーでレンチとかなんですかね。神経細胞とかだと培養を続けていくと神経形成のプロセスが進みDay4、Day8で違うステージで細胞の反応も違うということもあると思う。

形態を見るというのも微妙で観察、測定の仕方でいろいろと違う結果になったりもするのではと思いますが。

(無題)

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No.11877-2 - 2023/10/26 (木) 10:46:33 - Morgan

メンデルに対する熱い風評被害

遺伝子導入の結果をどう解釈するか。

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No.11877-1 - 2023/10/26 (木) 10:31:17 - Monkey

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