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(無題) 削除/引用 No.1188-11 - 2012/11/28 (水) 15:32:59 - かいこ MBPはうちでやったときも結合が不安定で、結局、あきらめました。原因は全くわからずじまいで。もちろん発現は確認していて、ややMBPに結合する傾向もあったのですが、洗浄だけで落ちてしまいました。ミステリーでしたが、別にこれにこだわる理由もないので。よさげに聞こえる割に使われてないのは、そういうことなのかと思ってました。

(無題) 削除/引用 No.1188-10 - 2012/11/28 (水) 10:09:11 - おお Amylose Resinはつかったことないですが、webとかちょこちょことみてるんですが、結合そがいするファクターはあまりおおくかかれてませんねえ。。。デタージェントとかはありますけど、、、phは七以上で八強ぐらいまでだいじょうぶそうですし、金属イオンは関与してなさそうだし、還元剤も大丈夫そうです。また高いイオン強度でも平気みたいです。 グルコースの精製度がひくくまるとーすがけっこう混じっているとか、、、webじょうではそう言うことが原因でつかないという記述はありませんでしたけど、、、

(無題) 削除/引用 No.1188-9 - 2012/11/27 (火) 18:27:01 - F.K mon さん ありがとうございます。 培地成分の洗浄をしていませんでした。 培地成分の洗浄を行い、もう一度行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.1188-8 - 2012/11/27 (火) 09:50:19 - mon これといって改善点を指摘できなくて申し訳ないですが、 残留している培地成分がビーズへの結合を阻害しているのかな？ 菌体を一度、懸濁用液で洗浄(懸濁・遠心）してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1188-7 - 2012/11/26 (月) 19:06:44 - F.K APさん ありがとうございます。 散らかってしまい、申し訳ありません。 MBPタンパク質の精製を行う前に、GSTタンパク質の精製を行っていた際は同様なプロトコールで上手くできたので、このようなプロトコールで行いました。 指摘して頂いた通り、製品のマニュアルを読み直してみます。 現在は予備実験でスモールスケールで行っています。 MBPの発現と可溶化、MBP融合タンパク質の発現と可溶化はCBB染色で確認できています。 不溶画分にもタンパク質は確認できますが、可溶画分にもタンパク質を確認できました。 大腸菌のwhole lysateでもMBPおよびMBPと目的タンパク質の発現を確認できております。 しかし、ビーズと反応させた後に、MBPおよびMBPと目的タンパク質を融合させたタンパク質が確認できません。

(無題) 削除/引用 No.1188-6 - 2012/11/26 (月) 18:37:58 - F.K monさん ありがとうございます。 説明が足りず、申し訳ありませんでした。 >(1)目的のMBPタンパク質は、MBP融合タンパク質ではないでしょうか？ もしそうなら、どれくらいの分子量のタンパクが融合しているのでしょうか。 MBPタンパク質およびMBPと目的のタンパク質約４５kDaを融合させたタンパク質の 精製を行っております。 他のタンパク質と融合させていないMBPタンパク質の精製も上手くいっておりません。 >(2)溶液量(uL)だけではなく、最終濃度を記載してください（あるいは原液濃度）。 IPTGはfinal 0.1mM Aprotinin 10μg/ml, Leupeptin 10μg/ml, PMSF 1mMで使用しております。 >(3)「プロテアーゼインヒビターで誘導」ではなくIPTGで発現誘導のハズです。 ご指摘の通り、プロテアーゼインヒビターではなく、IPTGで誘導です。 >(4)菌体をソニケーションしていますが、懸濁に用いた溶液（組成）は何でしょうか。また、どれくらいの菌体濃度でしょうか(OD600等またはg/ml）？ 20mM Tris-HCl(pH:7.4), 200mM NaCl, 1mM EDTAを用いて回収しております。 菌体濃度は量ってないです。 >(5)ビーズ30μlのカタログ上の結合容量はどれくらいでしょうか（mg) ビーズのbinding ca@acityは6-8mg MBP5-paramyosin ΔSal fusion protein/ml bed volumeです。 >Q.可溶化したタンパク質に目的のMBPタンパク質は含まれているのでしょうか？ また、おおよその量はわかりませんか？ 記載の条件だと、ほとんど発現誘導されていないような条件に思えます。 (定常期の大腸菌液を2倍に希釈して６時間も培養しているので。1時間もたたないうちに定常期=栄養不足になりそう） CBB染色の際に濃度既知のBSAを同時に泳動し、おおまかな目的タンパク質の濃度を予測しておりますが、1mlの可溶化した溶液中にMBPタンパク質が10μgあります。

(無題) 削除/引用 No.1188-5 - 2012/11/26 (月) 18:23:01 - F.K 〜さん ありがとうございます。 説明が足りず、申し訳ありませんでした。 MBPタンパク質およびMBPと目的のタンパク質約４５kDaを融合させたタンパク質の 精製を行っております。 >まず、たんぱく質が発現していることはどのようにして確認しているのでしょうか？ また、たんぱく質何mgとレジン何mLを混ぜているのですか？ タンパク質が可溶化できていることを7の遠心の後の上清をとり、CBB染色で確認しております。 CBB染色の際に濃度既知のBSAを同時に泳動し、おおまかな目的タンパク質の濃度を予測しておりますが、タンパク質10μgにAmyrose Resin10μlで反応させています。 今回は他のタンパク質と融合させていないMBPタンパク質の精製も上手くいっておりません。

(無題) 削除/引用 No.1188-4 - 2012/11/26 (月) 17:48:57 - AP なにか、いろいろととっ散らかっているふうですが、 pMALの発現システムはNew England Biolabの製品だったと記憶しますが、まずメーカーのマニュアルをよく読んで、忠実にしたがってやってみてはどうですか？　かなりいい加減にモディファイされた私家版マニュアルのようですが、初学者のようでもありますし教育上からも、まず基本に忠実にやるべきでしょう。いろいろ変更を加えるのは基本をマスターしてから。 発現誘導したときに、 ・まったく、あるいは微量にしか発現しない。 ・発現したタンパク質が不溶画分に行っている。 という可能性もあります。 スモールスケールでの予備実験、ラージスケール（本培養）の各段階でのサンプリングとチェックはどうなっていますか？ 大腸菌でこのような大量発現したときは、菌体をSDS-PAGEにかけCBB染色しただけでも、目的のタンパク質のバンドは区別できるくらい発現するもので、逆に発現量がそのレベルに達していないと、その先、見通しが暗いです。

(無題) 削除/引用 No.1188-3 - 2012/11/26 (月) 17:27:42 - mon 幾つか表現が不適切で、重要な実験内容が不明のところがあります。 (この内容だと再現実験ができません！） (1)目的のMBPタンパク質は、MBP融合タンパク質ではないでしょうか？ もしそうなら、どれくらいの分子量のタンパクが融合しているのでしょうか。 (2)溶液量(uL)だけではなく、最終濃度を記載してください（あるいは原液濃度）。 (3)「プロテアーゼインヒビターで誘導」ではなくIPTGで発現誘導のハズです。 (4)菌体をソニケーションしていますが、懸濁に用いた溶液（組成）は何でしょうか。また、どれくらいの菌体濃度でしょうか(OD600等またはg/ml）？ (5)ビーズ30μlのカタログ上の結合容量はどれくらいでしょうか（mg) それらを記述した上で、 Q.可溶化したタンパク質に目的のMBPタンパク質は含まれているのでしょうか？ また、おおよその量はわかりませんか？ 記載の条件だと、ほとんど発現誘導されていないような条件に思えます。 (定常期の大腸菌液を2倍に希釈して６時間も培養しているので。1時間もたたないうちに定常期=栄養不足になりそう）

(無題) 削除/引用 No.1188-2 - 2012/11/26 (月) 17:21:28 - ~ まず、たんぱく質が発現していることはどのようにして確認しているのでしょうか？ また、たんぱく質何mgとレジン何mLを混ぜているのですか？ プロトコルの10よりも前の段階で、目的タンパク質が発現していることやその量を確認しているステップがありません。 そのため、 >可溶化したタンパク質とビーズを混ぜても という話の前に、可溶化したたんぱく質が存在してるのかが分かりません。 存在しないたんぱく質は、カラムに結合しようがないでしょう。 また、たんぱく質の存在を確認したうえでの話であれば、 せっかくのコントロール付のベクターを使用しているのですから、 malE-lacZa も発現させて、こちらも精製してみてはいかがでしょうか。 目的たんぱく質により特異的に起こっている現象であるかが確認できるでしょう。

MBPタンパク質の精製について 削除/引用 No.1188-1 - 2012/11/26 (月) 16:53:09 - F.K いつも参考にさせていただいています。 学部4年で今年から研究を始めたものです。 MBPタンパク質の精製を行っているのですが、 精製が出来ません。 可溶化したタンパク質とビーズを混ぜても 結合が確認出来ませんでした。 どのような理由が考えられるでしょうか？ vectorはpMAL-c2xでビーズはAmylose Resinを使用しています。 プロトコールは以下の通りです。 1:グルコース入りのLB培地25mlにグリセロールストックを加え、37℃で一晩振盪培養 2：16h後、等量の培地を加えピペッティングして２つに分け、37℃で3h振盪培養 3：IPTGをそれぞれに6μlずつ添加して3h振盪培養 4：3500rpmて10min遠心して上清を除去後、プロテアーゼインヒビターで誘導(AP7.5μl、Leu7.5μl、PMRF37.5μlを添加してボルテックス) 5：10000rpm、2min遠心→10secソニケーション 6：5の行程を計3回行う 7：10000rpm、15min遠心して上清を新しいコーニングに移す 8：上清にビーズ30μlを加えて一晩ローテート 9：16h後、1500rpmで2min遠心して上清を 除去して、適量のbufferで洗浄 10：洗浄を計5回行ったらエッペンにビーズを10μl分注してサンプルバッファー5μl加えてCBBで発現確認。 このように行いました。 もしよろしければ お考えをお聞かせください。 よろしくお願い致します。

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