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(無題) 削除/引用 No.11886-12 - 2023/11/01 (水) 23:12:17 - SYBR master >[Re:10] G25さんは書きました : > 今はほとんどの制限酵素がrecombinatになっているのであまり重視されないと思いますが、制限酵素の品質検査でligation/recutting効率というのがあります。単一の制限酵素で生じた末端同士でもexo活性がコンタミしていると削られて再連結できなかったり連結できても認識配列が崩れて同じ制限酵素で再切断できなくなったりするから、それを評価するわけです。 あの表記って、このためだったんですか。何であるのか良く理解できていませんでした。コンタミするDNaseの有無のためだったんですね。しらんかった。 やっぱり、年寄りの経験は為になりますねｗ

(無題) 削除/引用 No.11886-11 - 2023/11/01 (水) 11:57:41 - AA タカラがPrimestar酵素を使ったmutagenesisとして、PCR産物をそのまま形質転換する実験の情報を出していますね。 ttps://catalog.takara-bio.co.jp/com/tech_info_detail.php?mode=3&masterid=M100002482 質問者さんのケースでの原因はわかりませんが、少なくとも直鎖のまま取り込まれるということ自体は現象としてよくあると思います。

(無題) 削除/引用 No.11886-10 - 2023/11/01 (水) 11:29:52 - G25 targetingなど色々な目論見で大腸菌にlinearのDNAを入れることがありますが、electroporationを使うことが多いと思います。おおさんの挙げた論文見て、chemical/heat-shockでもできるんだなあと知りました。 >ちらっと眼にしたんですが、サルモレラだっけかほかの菌種で直鎖DNAを（積極的？）に取り込むメカニズムがあるようですが、大腸菌にはないとかいうのが書いてあったような気がする。 枯草菌に積極的な機構があるけど大腸菌にはない、というのをなにかの論文でintroductionで読んだことはある。 >プラスミドの結合性のない突出末端同士が結合していました。 具体的にどの制限酵素末端で連結後にどんな配列になったいたかに興味あります。おそらく3'突出端どうしで、突出端の一部、あるいは全部（平滑端化）が削れて連結されたような配列になっているのではないでしょうか（NHEJとかMHEJにみられるような）。そういうのin vitro（exonuclease活性のコンタミとっかで）でも、in vivoでも起こり得ます。 今はほとんどの制限酵素がrecombinatになっているのであまり重視されないと思いますが、制限酵素の品質検査でligation/recutting効率というのがあります。単一の制限酵素で生じた末端同士でもexo活性がコンタミしていると削られて再連結できなかったり連結できても認識配列が崩れて同じ制限酵素で再切断できなくなったりするから、それを評価するわけです。in vivo (大腸菌内のDNA修復機構など）だけでなくin vitroでも起こりうるってのは、こういうことからも類推できます。

(無題) 削除/引用 No.11886-9 - 2023/11/01 (水) 10:58:33 - おお >[Re:6] おおさんは書きました : > >[Re:3] ああさんは書きました : > > > 大腸菌が直鎖DNAを取り込むことはなかったはずなので > > > > > > リファレンスを希望します。 https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12896-021-00679-6 直鎖DNAを直接大腸菌に導入して、菌内でリコンビネーションを起こさせているようです。 ちらっと眼にしたんですが、サルモレラだっけかほかの菌種で直鎖DNAを（積極的？）に取り込むメカニズムがあるようですが、大腸菌にはないとかいうのが書いてあったような気がする。そのために大腸菌は取り込まないと考えたのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.11886-8 - 2023/11/01 (水) 00:25:18 - SYBR master >[Re:4] ゆうさんは書きました : > インサートが20bp程度と短く、電気泳動での確認が難しいと感じたため、シーケンス解析しました。言葉足らずですみません。 T7とかでsgRNA作るやつ？cloningできない物は、いくら頑張ってもできない(知っているヒトは知っているけど、マジでできません）ので、他の方法考えた方が良いです。sgRNAなら分割すれば化学合成もできますし。 sgRNAやmiRNAなどは単なるツールでしか無いので、できないことはとっとと通過した方が良いと思いますよ。本来のテーマとは関係ないでしょうから。

(無題) 削除/引用 No.11886-7 - 2023/11/01 (水) 00:10:40 - SYBR master G25さんが突っ込むと思ったので、書き込むの躊躇したんですが >文章からだとライゲーション後の反応液をアガロースゲル泳動してないみたいなので 分子数考えれば、ligationしたあとで電気泳動で確認するなんて、アホしかしないでしょ。もしそれを君が毎回求められているなら、ずいぶんと古い方法(ligationに持ち込むDNA量がマイクログラムレベル）で、たぶん前世紀レベルもそれも初期レベルで有ると思います。 >大腸菌が直鎖DNAを取り込むことはなかったはずなので 普通に直鎖DNA取り込めます。oriが無いから増えないから見えないだけです。KO株とかどうやって作ったと思うの？ 一般的に使用されるT4 DNA ligaseはfidelityが低いので、 >プラスミドの結合性のない突出末端同士が結合していました。 確率は低いですけど、予期せぬ物のもできます。なのでいくつかのクローンを拾う必要があります。 おおさんの言っている >大腸菌ないに修復酵素群など、末端を平滑にしたりライゲーションしたりする酵素があるからね。 を避けるために、cloning用の大腸菌が用意されてます。そこら辺調べてから実験した方が良いと思いますよ。ネットで調べればそれに関するpdfとか落ちていると思います。日本語なので生物工学学会のpdfがよく解りやすいと思いマス。 また、逆にこれを利用してGibson assemblyやIn fusion等(少し違うけど）のcloningのためのキットが作成されて、販売されています。

(無題) 削除/引用 No.11886-6 - 2023/10/31 (火) 23:29:18 - おお >[Re:3] ああさんは書きました : > 大腸菌が直鎖DNAを取り込むことはなかったはずなので > > リファレンスを希望します。

(無題) 削除/引用 No.11886-5 - 2023/10/31 (火) 13:14:32 - ゆう おお様 起こりうることなんですね。 勉強になります。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.11886-4 - 2023/10/31 (火) 13:12:16 - ゆう ああ様 インサートが20bp程度と短く、電気泳動での確認が難しいと感じたため、シーケンス解析しました。言葉足らずですみません。 大腸菌が直鎖DNAを取り込まないことは知りませんでした。 勉強になります。ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.11886-3 - 2023/10/31 (火) 11:59:17 - ああ 文章からだとライゲーション後の反応液をアガロースゲル泳動してないみたいなので多分末端が結合したのではなく空ベクターが増えてしまったものかと思います。 制限酵素は必ずしも１００％出来るわけではないので酵素処理したベクター＆インサート同士のライゲーション反応液をそのまま導入するとインサートなしの空ベクターを持ったコロニーが出現することがあります。 大腸菌が直鎖DNAを取り込むことはなかったはずなのでセルフライゲーションしない突出末端の直鎖DNAに大腸菌が何か影響を与えるのは違うかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.11886-2 - 2023/10/30 (月) 23:07:15 - おお 大腸菌ないに修復酵素群など、末端を平滑にしたりライゲーションしたりする酵素があるからね。そう言うクローンがバックグラウンドとしていくらか拾えるのは普通起こること。これが起こらないなら100%ライゲーションが成功したクローンでミニプレップでインサートの確認は必要ないことになる。

ライゲーション 削除/引用 No.11886-1 - 2023/10/30 (月) 22:04:29 - ゆう ライゲーションにおいて、結合性のない突出末端同士が結合する原因は何でしょうか。 制限酵素処理して生じたプラスミドベクターの突出末端に対し、インサートを挿入するライゲーション反応を行いました。反応液を用いて大腸菌に形質転換し、再生したコロニーからプラスミドを調製しました。シーケンス解析の結果、インサートは挿入されておらず、プラスミドの結合性のない突出末端同士が結合していました。 このような現象が起こった経験のある方はいらっしゃいますか。 また、ライゲーション反応自体によるものではなく、形質転換後に宿主が何らかの影響を及ぼした結果なのでしょうか。 私の経験不足で、原因が分からず困っています。 よろしくお願いします。

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