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(無題) 削除/引用 No.11905-15 - 2023/11/14 (火) 13:48:18 - LPS momoさん、 とても参考になる資料をあげていただき、ありがとうございます。 ２段階の反応にすることで、感度を稼ぐこともできそうですね。

(無題) 削除/引用 No.11905-14 - 2023/11/14 (火) 12:47:40 - momo 新しい総説もありました。 PMID: 37031620

(無題) 削除/引用 No.11905-13 - 2023/11/14 (火) 12:37:28 - momo 五月雨式ですみません。カテプシンの活性を組織染色できるプローブです。 https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2019/sc/c9sc00997c

(無題) 削除/引用 No.11905-12 - 2023/11/14 (火) 12:33:24 - momo たとえばこの論文ではシステインプロテアーゼ（パパイン）と共有結合した阻害剤にクリックケミストリーでローダミンをくっつけてますね。 https://www.jstage.jst.go.jp/article/cpb/68/11/68_c20-00547/_article

(無題) 削除/引用 No.11905-11 - 2023/11/11 (土) 09:58:24 - momo プロテアーゼ活性依存的に活性部位に共有結合する阻害剤がありますので、それを何らかの方法で検出するというのはどうでしょう。蛍光ラベル、クリックケミストリー、抗体染色などが使えそうです。

(無題) 削除/引用 No.11905-10 - 2023/11/11 (土) 05:41:39 - LPS みなさん、そしておおさん、 色々と調べていただきありがとうございます。 出来合いのもはやはりなさそうですが、色々とアイデアを出して頂き、とても参考になりました。 すみません、ターゲットを記載するのを忘れていました。ターゲットは細胞上に出現すると思われるプロテアーゼで、刺激しても全ての細胞が発現するようにはならない様なので、発現している細胞をなんとか簡単に可視化出来ないかと考えたのです。 とりあえずは、他のことから着手していこうと思います。 読んでいて、パズル解きみたいで面白かったです。

(無題) 削除/引用 No.11905-9 - 2023/11/11 (土) 02:57:07 - おお ＞たぶんH2O2を発生させた時点で たぶんH2O2からラジカルを発生させた時点で 訂正します

(無題) 削除/引用 No.11905-8 - 2023/11/11 (土) 02:53:50 - おお peroxidaseをプロテアーゼで活性化できればとググってみました。 https://link.springer.com/article/10.1007/s12274-018-2241-3 アブスト程度しか見てないですが、 plasmonic gold nanoparticlesの peroxidase-mimicking activityを利用しているようですが（あるいは何らかのperoxidase-mimicking activityを持つものをつけているのか）、それにカゼインをコートしてperoxidaseを抑制したものを用意している。プロテアーゼがあるサンプルに加えるとカゼインが分解されてperoxidase-mimicking activityの部分が露出しperoxidase検出用の発色試薬でプロテアーゼが検出できるというもの。昔はWBもDAB、4CN, TMB, NBT/BCIPなどの発色で見てましたから、WBで使われるような膜であれば発色後膜に沈着するでしょう。 またperoxidase activityがあるなら、Tyramide signal amplificationが使えるかもしれません。蛍光色素にTyramideがついていてHRPなどで活性化し、周りのタンパクなどの結合するというメカニズムです。論文で使われているgold nanoparticlesがうまくTyramideに作用するかよくわかりませんけど。たぶんH2O2を発生させた時点でそのあとは一緒なのでうまくいきそうには思えますが。 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c08280 ascorbate peroxidase（APEX)というのがあってこれをTagとして目的のたんぱく質に融合して、Bitotin-phenolを加えるとBitotinがその周りのタンパクに結合して、Interactionしているタンパクが標識されるというもの。 それをプロテアーゼで活性化するようにしたタンパクを紹介しているのが上の論文。論文ではEGFPをつけているが、それは構造的に同じ働きをすれば何でもよくて、Bitotin-phenol存在下、膜上でプロテアーゼ活性があるところでAPEXが活性化すればその近傍でBiotinが吸着するということも可能かもしれない。 タンパクにラベルが入るということだから、膜をBSAなどでプロッキングを兼ねて吸着しておけばいいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.11905-7 - 2023/11/10 (金) 09:48:12 - toto ２つの蛍光基をペプチドで繋ぐFRETが高感度になりそうです。Westernでも基質が沈殿しなくても、そこで蛍光が検出できれば使えるような気はします。やってみたことないですが。 これには、蛍光基Aにペプチドを繋いでその片方に別の波長特性の蛍光基Ｂまたは、クエンチャーＢ’を繋いでFRETが起きるようにしておいて、普通はAの蛍光が出るか、全く蛍光が出ない（後者）ような基質を作り、ペプチドが切れたら、Bの蛍光か、後者の場合はAの蛍光が出るようになる、という感じです。たとえば https://www.nature.com/articles/s41598-020-67578-2 にあります。探せばいろいろと出てます。

(無題) 削除/引用 No.11905-6 - 2023/11/10 (金) 09:01:23 - おお 思い付きでひとつ。切断部位を認識する抗体（N or C末端になった部分だけ認識する抗体）を膜上に固定する。基質は蛍光などの色素をつけたペプチドで切れると膜上の抗体に認識されるのでそこにその色素がとどまる。

(無題) 削除/引用 No.11905-5 - 2023/11/10 (金) 06:21:31 - おお 認識配列のペプチドにアルデヒドなどをつけて阻害する、プロテアーゼインヒビターがありますけど、たぶんそういうのはコバレントに結合するからだと思ってます。ですからさらにそういうインヒビターに蛍光色素をつけると特異的に蛍光標識ができそうな気がしますがどうでしょうか。 https://www.peptide.co.jp/custom/peptide_synthesis/inhibitors

(無題) 削除/引用 No.11905-4 - 2023/11/10 (金) 06:12:27 - おお https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400519316417#sec0025 失礼しました、Zymographyはだめということを見落としてました。 上記の文献はAuなのパーティクルに基質をつけたものを使用しています。基質が切断されるとチャージを持ったアミノ酸を放出するので、Auに残ったペプチドの電荷が減り、Au同士があぐりけーしょんを起こすそうです。そして吸収スペクトルも変わる。 お考えのアッセイで使えるかどうかわかりませんが参考までに。

(無題) 削除/引用 No.11905-3 - 2023/11/09 (木) 12:17:11 - G25 >基質を溶かしたゲルを重層するような方法は考えていません。 いわゆるZymographyは考えにいれないということですね。 昔と違って今は便利そうな市販品もあるようですが。 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/protein-biology/protein-gel-electrophoresis/protein-gels/specialized-protein-gels/zymogram-gels.html 発色ならこういうのが使えるかもね。 3CNAとかBCIとか。BCIはフォスファターゼ染色のBCIPと同様NBTと組み合わせるといいのかも。 https://bizcomjapan.co.jp/iris-biotech/products/biochem-molbio-tools/reporter-enzyme/protease/ ただ特注によるペプチド合成になるようで費用が高額になりそうだし、この会社がそういうサービスを継続しているのかわからなかった。

(無題) 削除/引用 No.11905-2 - 2023/11/09 (木) 10:48:08 - おお そういうのは知らないけど、SDSPAGEゲルに基質（コラーゲン）を混ぜておいてサンプルを泳動後、反応用バッファーにゲルを入れてインきゅべーとすると、プロテアーゼのある所だけ基質が消化されて、その後CBB染色すると基質が消化されたところがCBBで染まらないので、プロテアーゼが検出されるというのがありました。 酸化還元だけどMTTとかは反応後析出するけどね。

沈殿物を生じるプロテアーゼ基質 削除/引用 No.11905-1 - 2023/11/09 (木) 07:52:31 - LPS いつも助けて頂いてとても感謝しています。 ところで、酵素反応後、沈殿物を生じる合成基質をご存じでないでしょうか。 蛍光でも、発色でも、化学発光でも構いません。ターゲットの酵素はプロテアーゼです。AIとかも使って探しているんですが、探し方が悪いのか見つかりません。 Westernのような感じで、プロテアーゼが検出できる方法を探しています。とりあえずは、基質特異性は考慮しない分でも結構です。基質を溶かしたゲルを重層するような方法は考えていません。 よろしくお願いいたします。

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