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ご回答ありがとうございました 削除/引用 No.11920-4 - 2023/11/17 (金) 16:02:20 - 匿名でお願いします 774R様・G25様 　投稿者です。 　ご回答いただきありがとうございました。 　PCR産物の解釈や、プローブの設計について知りたかったことが明らかになり大変助かりました。 　まずは、現在のSYBR Green assayでプロトコルの改良を検討してみます。 　その上で、綺麗に増幅するようになればTaqman assayも検討してみたいと思います。 　ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11920-3 - 2023/11/15 (水) 16:55:06 - G25 配列が乱れていたり、サイズが違ったり不正なPCR産物ができるような系ではTaqMan probeにしたところで問題は解決しないと思います。標的外の産物が増幅することで標的の増幅は干渉をうけるし、配列な配列とキメラになっている産物にプローブがハイブリしても何を測定しているのかわからんじゃないですか。 無理にPCRかけると、pCR産物やインプットのDNAが不正なアニールと伸長をおこし、DNAの重合体やキメラを生じます。あなたのみているのは多分そういうことです。まずは、標的がわずかでもきれいにPCRできるような系を立てることです。酵素を変える、プライマーを新調する、プライマーの濃度を変える、そんなことだけでも改善することがあります。

(無題) 削除/引用 No.11920-2 - 2023/11/15 (水) 15:24:02 - 774R >この増幅産物の塩基配列をサンガーシーケンスで読んだところ、最初の方は（5'末端側）目的の増幅産物の塩基配列と一致しており、その後ろ（3'末端側）ではよく分からない汚い（クオリティの低い）配列が続いていました。 これについては、途中までは目的配列とのことなので、後半からヘテロな物が混じっていて波形が重なった結果と考えます。 いずれにしても、特異性の点ではTaqMan法の方が有利ですので試す価値はあります。 原理的には、プライマーが本当に種特異的にしか増えないのであれば、プローブは種特異的である必要はないはずですが、もし可能ならプローブも特異的にした方が２重に安心ですね。

qPCRでのSYBR Green assayからTaqMan assayへの変更可能性 削除/引用 No.11920-1 - 2023/11/15 (水) 10:51:54 - 匿名でお願いします 分子生物学初心者です（既出でしたら申し訳ありません）。 現在、環境試料（土壌から抽出したDNA）から、特定の真菌のDNAを検出・絶対定量するための種特異的プライマーセットを設計し、SYBR Green assayによるリアルタイムPCR実験を行っています。目的の増幅産物サイズは110bpで、45サイクルのプロトコルで実施しております。 スタンダード（純粋培養した目的の菌のgDNA）やDNA濃度が濃い環境試料では良好に増幅し、融解曲線では79℃付近に単一のピークがみられます。また、この増幅産物の塩基配列をサンガーシーケンスで読んだところ、配列にも問題ないことが分かりました。 一方で、DNA濃度が薄い環境試料では、融解曲線のピークが79℃と90℃付近に現れ、二山型となってしまいます。 この増幅産物の塩基配列をサンガーシーケンスで読んだところ、最初の方は（5'末端側）目的の増幅産物の塩基配列と一致しており、その後ろ（3'末端側）ではよく分からない汚い（クオリティの低い）配列が続いていました。 なお、NTCの増幅は認められませんでした。 現時点の結論では、目的の菌がある程度の存在する（濃い）サンプルでは問題なく検出できるが、わずかにしか存在しない（薄い）サンプルでは検出できない＝検出感度が低いというふうに解釈しており、上司に相談したところ、プロトコルの改良やTaqMan assayへの変更を助言されました（検出感度をもう少し上げたいとのこと）。 このような状況ですが、下記3点につきましてご教示いただけましたら幸いです。 �@DNA濃度が薄いサンプルでの融解曲線の解釈について 　目的の増幅産物よりも長い増幅産物については、所謂プライマーダイマーではなく、目的の増幅産物の後ろに何らかの理由で色々なものがくっついてしまっている状態だという解釈で問題ないでしょうか？ 　だとすると、Tm値を上げる等のプロトコルの改良で対応可能な問題でしょうか？あるいはプライマーの設計からやり直すべきでしょうか？ �ATaqman assayにおける種特異性の確保について 　今回の件とは別に、一般的な話として、TaqMan assayの場合には、種特異的プライマーセットで特異性が確保されていれば、プローブ自体の配列には特異性を考慮する必要はないでしょうか（アニーリング温度等の特異性以外の条件は満たすと仮定します）？ �B今回の実験におけるTaqMan assayへの変更可能性について 　�@�Aに問題が無ければ、今回設計した種特異的プライマーセットの増幅産物の真ん中あたりにプローブを設計して入れてみようと考えています（種特性はプライマーセットで確保されているので考えずに、アニーリング等の条件のみを検討）。TaqMan assayでは一般的に融解曲線解析は不要と思うのですが、これにより、�@の問題を回避して検出感度を上げることはできそうでしょうか？ 不慣れなため、変なことを聞いていたら申し訳ありません。 どうぞよろしくお願い申し上げます。

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