バッファについて大事なこと書き忘れていました。通常、0.1%、あるいは0.5%か1％程度のBSA入れています。 BSAには色々なグレードのものがあって、EIAやRia用とメーカーが明記しているものがよいです。
さらにペプチドのアッセイの場合には、タンパク分解酵素フリーのものの方が安心です。いずれにせよメーカーは、価格と品質の安定性から国産の方が好きです。
一例ですが、アッセイバッファとしては、次のような場合もあります:
0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 300 mM NaCl, 0.1% (w/v) BSA and 0.01% (w/v) triton X-100
ターゲットの親油性が高そうな場合や、後で書く、マトリックス効果がありそうなときは、tween20も添加することもあります。
先の書き込みで書かなかった点は、説明を簡単にするために、第二抗体を固相化する、競合法アッセイで説明します。この場合、スタンダードカーブは、濃度ゼロが吸光度が一番高くて、右下がりのS字状カーブになり、高濃度のスタンダードの吸光度は低値になるようにする必要があります。
まず96ウェルプレートへの第二抗体の量は多めで、これの量に悩まないように次の様なワンパターンです:
6.25 µg per well of anti-mouse IgG rabbit antibody in a final volume of 150 µl, and blocked with 300 µl/well of 1% BSA
これらの準備の後にまずすることは最適な第一抗体濃度決定です。第一抗体をまず1万倍希釈して、その後さらに、2万倍、4万倍、、、1024万倍希釈した液を作ります。これらを用いて濃度ゼロのスタンダードだけを用いて、ＨＲＰとTMBなどによる発色まで進めて、x軸が濃い方から薄い方への濃度でy軸を吸光度とするグラフを描くと、右下がりのS字状カーブになります。抗体が濃すぎると標識ホルモンと非標識ホルモンの間の競合が起きない。抗体が薄すぎると、濃度ゼロでさえ発色が薄すぎるということになる。そのため、右下がりの途中の濃度を選択する。
次のステップについては次に続く。 |
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