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(無題) 削除/引用 No.11939-8 - 2023/11/23 (木) 00:45:01 - 忘れん坊 ごめんなさい、もう一つ聞いてもよろしいでしょうか。 冷凍庫にあるプライマーの在庫を確認したところ、例えば18SがVICで、ターゲットにしているプライマーがFAMであったりします。VICとFAMのプライマーを1枚のプレートに入れてrunしても比較できるでしょうか？ddCt法で比較します。同じDyeじゃないとダメでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11939-7 - 2023/11/23 (木) 00:39:47 - 忘れん坊 まさにquant studio 3です。SNP genotypingもおもしろそうですね。（正直よくわかっておりませんが。）今後の参考にさせていただきます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11939-6 - 2023/11/23 (木) 00:37:08 - 忘れん坊 詳しい解説ありがとうございます。非常に参考になります。ThermoFisherとも相談しながら、まずはシングルでプロトコールを確立していこうと思います。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11939-5 - 2023/11/23 (木) 00:35:46 - たこ ちょっと使用例は異なるかもしれませんが、FAMとVICでSNP genotypingとかやってた記憶があります。 マシン側が対応していれば使えるはずですよ。 たしか私はstep one plusとquant studio 3を使っていたはずです(うろ覚えですみません)。

(無題) 削除/引用 No.11939-4 - 2023/11/22 (水) 14:48:08 - Ca VICではないですが、VICと似た励起・蛍光波長をもつTAMRAとFAMでマルチプレックスPCRを行っていて、問題なく結果が得られております。 aaさんのおっしゃる通り大抵のqPCR装置はFAM, VICに対応していると思いますし、現在使用できる2台の装置どちらでも同様の結果になっています。 FAM　励起波長：495nm、最大蛍光波長：530nm VIC　励起波長：520nm、最大蛍光波長：549nm TAMRA励起波長：550nm、最大蛍光波長：580nm ただ、上記のようにFAMの最大蛍光波長がVICの励起波長と10nmしか変わらないので、マルチにするとFAMの蛍光取得の際にVICの励起光が入り込んで本来の蛍光を取得できないということがあり得るかもしれません。 ここはqPCR装置がどのような形で蛍光を取得するかに依存するので、調べてからの方が良いかと思います。 また、マルチではプライマーの濃度設定など苦労したこともあるので、手っ取り早くデータを取得したいならシングルの方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.11939-3 - 2023/11/22 (水) 10:40:00 - 忘れん坊 aa様 ありがとうございます。PLって何だ？と思っていたのでよくわかりました。 マルチプレックス、よさそうですがやっている人はいますか？ハウスキーピングも何種類か試したい気もしそうですが。サンプルやマスターミックスは多く使うことになりますがシングルのほうがいいですかね？

(無題) 削除/引用 No.11939-2 - 2023/11/22 (水) 10:02:17 - aa 大抵のqPCR装置はFAMとVICに対応していると思います。 ターゲットをFAMで、18sをVICラベルのマルチプレックスで使用するなら、18sのPrimerを選ぶときにVIC-MGBではなく、VIC-MGB-PLを選ぶのを忘れずに。 PL=Primer Limited、プライマー濃度が低くなっています。18sなどの内在性コントロールは低いサイクル数で増えるので、同じウェルのヌクレオチドをPCRの早い段階で使い果たしてしまうことで、ターゲット遺伝子の増幅に影響するのを防いでいるとのことです。

FAMとVIC混ぜることはできる？qPCR 削除/引用 No.11939-1 - 2023/11/22 (水) 08:18:37 - 忘れん坊 いつも参考にしています。最近研究室を移動したのですが、新転地で自身の5年以上ぶりにqPCRをやることになり、記憶を呼び覚ましているところです。ThermoFisherでTaqMan Probeを購入する予定ですが、DyeがFAMとVICがあります。例えば、18s-VICのプローブと、自分のターゲット遺伝子‐FAMのプローブを混ぜて1ウェルのリアクションはできましたっけ？分けないとだめですか？検出機器次第でしょうか？マスターミックス次第でしょうか？昔はずっとFAMを使っていて1ウェル1ターゲットでやっていましたが、ここの研究室のプローブはVICをよく使っているようなのでそういえばできたっけ？とふと思いました。よろしくお願いします。

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