BioTechnicalフォーラム [ウエスタンブロットのマーカーが黒くなるのを防ぎたい]

ウエスタンブロットのマーカーが黒くなるのを防ぎたい

No.11940-TOPIC - 2023/11/22 (水) 18:46:01 - usanori

こんにちは。
いつもお世話になっております。

ウエスタンブロットのマーカーが黒く塗りつぶされたかのように検出されてしまう理由と対策を知りたいです。

具体的に書きます。

私はとある受容体をウエスタンブロットで検出する際、ローディングコントロールとしてチューブリンを使用しています。

とある受容体の検出でマーカーは黒く塗りつぶされない(一部黒くなっている時もありますが)のに、チューブリンの検出になるとマーカーのほぼすべてのバンドが塗りつぶされてしまいます。

使用しているバンドはBIORAD製のPrecision Plus Protein™ Dual Color Standardsです。

黒く塗りつぶされると言っても、バンドの上に綺麗に重なるような形なので問題ないのですが、たまに太すぎてバンド同士が結合して見えるのが困っています。
あと、マーカーのバンドの上を綺麗に黒く塗りつぶされる理由が純粋に知りたいと思って調べたのですが答えが得られなかったのでこちらで質問させていただきました。

写真を載せられたらより分かりやすいのですが・・・、
マーカーのバンドが青とピンクで見えるはずなのに、その上に新たに黒いバンドが重なっているイメージです。

なぜなんでしょうか？
ブロッキング剤の除去が甘く、抗体が結合してしまっているのでしょうか？
それならマーカーのバンドの上を綺麗に黒く塗りつぶすのではなく、全体的に真っ黒になるような気もするのですが…。

対策もあったら教えて頂けるとうれしいです！

よろしくお願いします。
　

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No.11940-13 - 2023/12/15 (金) 18:12:24 - あの

マーカーを別のものにしてみたらどうですか？

やってみました！

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No.11940-12 - 2023/12/15 (金) 16:08:58 - usanori

1.サンプルのアプライ量を減らす
2.抗体の希釈濃度を上げる

結果
1.サンプルのアプライ量を減らす
→変わらずにマーカーが黒く染まりました。

2.抗体の希釈濃度を上げる
元々、一次抗体＝1：5000、二次抗体＝1：3000
↓
①一次抗体を1：10000に、二次抗体はそのまま
②二次抗体はそのまま、二次抗体を1：10000に

→変わらずにマーカーが黒く染まりました。

恐らくですが、一次抗体が古い可能性が濃厚です。
新しく買い直す機会が今のところないので、買ったらまたご報告します。
（需要があるかは分かりませんが…）

皆さま、ご教授ありがとうございました！

(無題)

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No.11940-11 - 2023/11/29 (水) 11:00:24 - usanori

皆さん

沢山のご教授、ありがとうございます！

同じような現象が自分だけじゃないこと、解決策があることを知れてよかったです。

皆さんの方法を試してみての結果報告もしたいので、このトピックはまだ解決せずに残しておきます。

本当にありがとうございました！

(無題)

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No.11940-10 - 2023/11/29 (水) 10:57:34 - usanori

たこさん

同様の現象が起きて実際解決されたんですね！

サンプルのアプライ量を減らすと検出が低くなってしまうので、ひとまず抗体の希釈濃度を上げてみようと思います。

それでもダメならマーカーを切り出して抗体反応させず、検出までお眠りいただこうかと思います。

ありがとうございます。

(無題)

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No.11940-9 - 2023/11/29 (水) 10:54:25 - usanori

おおさん

解答ありがとうございます！
マーカーのバンドのタンパク量が多いからクロスリアクトしてしまうことがあるんですね…。

他の方も仰ってらっしゃるように、
・抗体の希釈濃度を上げる（現在は1次抗体が1：5000なので1：10000などにしてみる）
・マーカーのレーンだけ切り取って抗体反応させない
をやってみようと思います。

ありがとうございます！

(無題)

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No.11940-7 - 2023/11/28 (火) 04:35:57 - たこ

私の使用している抗体でも同様の現象が起きましたが
1. サンプルのアプライ量を減らす
2. primary antibodyの希釈倍率を上げる
3. secondary antibodyの希釈倍率を上げる
それで解決できることがほとんどでしたが、それでもダメな場合(His-tag抗体はいつもですが)
4. マーカーの隣を１〜２レーンあけて、転写後に空白レーンのところをメスで切り離して検出の時までマーカーにはお眠りいただく
というようにやっています。

(無題)

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No.11940-6 - 2023/11/28 (火) 02:57:01 - おお

同様の質問をしたことがあります。チューブリンではなかったと思いますが、抗体によっては反応します。回答くださった人の中で（多分メーカーは違うと思いますが）、メーカーに問い合わせたところ、マーカーのバンドのタンパク量がWBの検出量範囲より遥かに多いのでクロスリアクトが認められることがあるといったような回答があったと言うようなことをおっしゃってました。

いくらか工夫をするならば、
抗体の量、反応時間を減らす。
マーカーのロードする量を減らす。
面倒だけどバッファーなどの最適な条件をみつける。チューブリンほどタンパクがあるならバッファーにTX-100とか加えてもいいかもしれない。
マーカーの隣のレーンを開ける。
マーカーのレーンだけ紙などで遮って検出する。
マーカーのレーンは切り取って抗体反応せず、検出時に添える。
抗体を変えてみる（違うモノクロとか）

(無題)

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No.11940-5 - 2023/11/27 (月) 16:11:33 - usanori

qqさん

トピックを見てくださりありがとうございます。

使用しているTublinの1次抗体や2次抗体を調べましたがHis-Tagではありませんでした。

(無題)

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No.11940-4 - 2023/11/27 (月) 16:07:09 - usanori

あのさん

ご返答と実施している方への確認、ありがとうございます！

確かに何度も凍結融解しています…。

他人が購入した抗体を使わせてもらっているので、次自分で購入する際は分注して行ってみようと思います！

ありがとうございます。

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No.11940-3 - 2023/11/22 (水) 19:31:32 - qq

抗体にHis-tag抗体を使っていませんか？