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(無題) 削除/引用 No.11941-2 - 2023/11/30 (木) 09:02:19 - Kras Cas9発現細胞の作成方法にもよりますが、sgRNA導入前でもある程度バラついていると思います。なのでsgRNAコンストラクト導入でGFP増強自体は起こると思われますが、それでMOIまで判断するとなると、何かしら恣意的に判断せざるを得なくなって悩む事になるかもしれません。 puromycinで判断されるという事は、sgRNAのコンストラクト上にpuromycin耐性遺伝子（Puromycin N-acetyltransferase, PAC）も載っているのだと思われます。MOI決定の際にはanti-PAC 抗体で染色して判断するのも一案かもしれません。

Cas9スクリーニングにおける蛍光の問題点 削除/引用 No.11941-1 - 2023/11/23 (木) 18:37:40 - D Cas9スクリーニングを行う予定です。 コラボレーターからCas9を発現する細胞をもらい、自身で最もコモンなsgRNAライブラリーを入手したのですが、いずれもGFPがコンストラクトに含まれています。つまり、いただいたCas9はGFPを発現し、sgRNAライブラリーもGFPがプラスミドに含まれている状況で、少しイレギュラーです。 FACSでのソーティングによるpositive screeningでさらにカラーを使うので、このカラーの重複をあえて、甘受しようと思っているのですが、スキーム的に大きな問題でしょうか。 基本的には、puromycinセレクションを主体にする予定で、MOIの決定にはGFPが増強しているかで判断しようと思っています。どこまでreliableかはやや未知数ですが。

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