BioTechnicalフォーラム [pLKO3G vectorへのshRNA断片のクローニング失敗]

pLKO3G vectorへのshRNA断片のクローニング失敗

No.11943-TOPIC - 2023/11/24 (金) 13:21:09 - pLKO3G

参考にさせていただいております。
pLKO.3G vectorへのshRNA断片のクローニングに失敗しており、解決のためのお知恵を拝借いたしたく、投稿いたしております。

pLKO.3GをEcoRI, PacIでDouble digestし、それに合うインサートをクローニングしようとしています。
トランスフォーメーションしてもインサートなしのネガコンと同程度の数しかコロニーが生えず（0～10個）、どれもpLKO3Gベクター全長の8102bpよりも非常に短いものばかりです(2000bp以下)。
解決法について、ご提案いただけますと幸いでございます。よろしくお願いいたします。

下記に備考を記載します。
・インサートは化学合成したものをアニーリングしたものです。デザインはAddgeneの指示の通りのつもりです（#14748）。
Forward oligo: 5'-AATT—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTTTAT-3'. Reverse oligo: 5'-AAAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense-3'.
例えば、下記の様なものです（Control shRNA用の配列）。
Fw: AATTTTCTCCGAACGTGTCAGCTTTCTCGAGAAAGCTGACACGTTCGGAGAATTTTTTTAT
Rv: AAAAAAATTCTCCGAACGTGTCAGCTTTCTCGAGAAAGCTGACACGTTCGGAGAA
アニーリング条件は他のベクターではうまくいっているので、悪くはないと思っています。バッファーをいくつか試しましたが、結果は変わりませんでした。

・Ligationに使用したDouble digestしたベクターは、バンドサイズ（約8000bp）を確認し、ゲル抽出したものです。脱リン酸化は無しです。

・CompitentはDH5aを使用しています。AddgeneのHPではStbl3です。
　

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No.11943-6 - 2023/12/12 (火) 10:57:46 - pLKO3G

時間がたってしまいましたが、報告だけさせていただきます。
NEBstableを使用したところ、正しい大きさのプラスミドがとれました。ご指摘いただいたように、おそらくRepeat配列が原因だったものと思います。
ありがとうございました。

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No.11943-5 - 2023/12/01 (金) 12:09:39 - pLKO3G

toto様
ご経験をご教授いただき、誠にありがとうございます。参考にいたします。

(無題)

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