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(無題) 削除/引用 No.1196-22 - 2012/11/30 (金) 07:34:25 - おお プレート上での培養のほうが、液体培地より調子がいいと聞いたことがあります。ただしコロニーが大きくなりしっかりと認識できる程度になってくると、死菌もふえてくるようで、プレート上で培養すればいいという話をしたら、そう言う理由でやらないというひともいます。 ファージのライブラリーを作るとき大腸菌をドロドロの薄いアガロースの入った培地をつかって、それを震とうさせ液体培地のようにして増やすようなプロとコールもあるようですが、詳細はわすれました。普通のDNA精製方法ではアガロースはじゃまになりそうです。

(無題) 削除/引用 No.1196-21 - 2012/11/29 (木) 20:30:42 - 自信なし おおさん 尿素を使って毒性のあるものをしっ活させる方法、非常に魅力的です。 カラムを使わなくてもよいというのは非常にコスパから言っても最高ですね。 一度落ち着いたら自分の目と腕で確かめてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1196-20 - 2012/11/29 (木) 20:29:26 - 自信なし KYさん おおさん この度は私のトピックにアドバイスいただき本当に感謝しております。 実のところ、このコンストラクションに３週間を費やしてしまっていました。 もちろん他の実験も平行して進めていましたが、ほんとに情けない想いです。 昨晩、ligation後のLA plate（Vec:Ins＝1:10）からコロニーを3つ pickして、colony sequenceをすると同時に、100 ulのLAに再懸濁させ、LA plateにまき直しました。O/Nカルチャー後、dish一面に生えた菌を1.5 mlのLAを加える事で回収し、P1, P2, P3を加え、遠心後、giagenのminiprepカラムで精製してみました。 すると5-7 ug程度のplasmidが回収できました。本当に、本当にありがとうございます。 これでようやくtransfectionができます。ウイルスを一度作るだけなので、これだけあれば充分です。 残念ながら、なぜ、LA plateのコロニーが液体培養すると増殖しないかはわからずじまいでしたが。。 このトピックで多くの事を学びました。その多くが実験指南書には書かれていない、実験担当者らの経験に基づくセンスが問題を克服するだけの強さを持つ事を意識しました。 KYさん おおさん 本当にありがとうございました。 また、最初の方でもアドバイスいただいた皆様方、心からお礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1196-19 - 2012/11/29 (木) 09:03:28 - おお >[Re:16] 自信なしさんは書きました : > KYさん > ありがとうございます。 > 大変驚いています。自分の不勉強を痛感しておりお恥ずかしい次第です。 > そうなのですね、2 mlから取れるのですか。いつもは100-200 mlの液体培養から100-200 ugのplasmidを得ていました。（キアゲンさんのplasmid extractionカラムを使用） > > では、一度plateで得られたコロニーを一つpickして、再度plateにまいてみます。 > ちなみに細胞へtransfectionするplasmidのpurityのグレードはどうしたらよいでしょうか？ > いつものminiprepは自分の手で、P1, P2, P3を順次加えて、その後フェノクロ抽出、エタチンです。ですが、このグレードではtransfectionに充分ではないですよね？（以前、これで調製したplasmidをtransfectした時、ほぼポジコンのGFP陽性細胞がいませんでした。理由はわかりませんが、エンドトキシン等が入っているからなのかなと思っています。。） > > この場合のminiprepはキアゲンさんなどのsmall scaleのカラムを使うべきなのでしょうか？ > すみませんこの辺り精通しておりません。どうかご教示いただけますと幸いです。 > > www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1180 ここに尿素をつかったてまえみその精製方法をかいています。PEGしたあと尿素を使うぐらいでたいてい毒性がなくなります(といっても非常にセンシティブな細胞ではよくわかりませんけど)。 またTRITON X-114などをつかってLPSを除去する方法もあります。シグマにきっとがありますが、キットでなくてもできます。いくらか改良されたほうほうもありますので、使いやすいほうほうをためしてみればとおもいます。 www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269712001054 www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e4274?lang=en&region=US www.promega.com/resources/articles/pubhub/enotes/what-methods-exist-to-remove-endotoxin-contamination-of-plasmid-dna/ ちなみにQiagenのDEAEカラムの精製はたしかTRITONX100を洗うときに使い、これでLPSがおちるようです(かってな憶測ですが、、、間違っていたならしてきしていただければと、、、)。むかしのﾌﾟﾛメガのきっとは方法からおそらくTRITONX114が使われている物があったとおもってます。今同じものが売られているかわかりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.1196-18 - 2012/11/28 (水) 22:42:25 - 自信なし KYさん ありがとうございます。 > 培養細胞へのトランスフェクションであればキアゲンのminiprepキットでカラム精製したほうがいいです。というか精製なしだと、細胞がかなり死んでしまいます。 > 個人的にはPromegaのWizardカラムも好きですね。 諒解しました。大変勉強になりました。ありがとうございます。 > いつもmidiprepするのはコスト的にももったいないと思います。大量に必要でない限りは。 こういう感覚は恥ずかしながらありませんでした。 なんでもかんでもmidiprepするものとばかり思っていた自分が非常に恥ずかしく情けないです。 教えていただき本当に感謝しています。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1196-17 - 2012/11/28 (水) 22:24:15 - KY > この場合のminiprepはキアゲンさんなどのsmall scaleのカラムを使うべきなのでしょうか？ > すみませんこの辺り精通しておりません。どうかご教示いただけますと幸いです。 > 培養細胞へのトランスフェクションであればキアゲンのminiprepキットでカラム精製したほうがいいです。というか精製なしだと、細胞がかなり死んでしまいます。 個人的にはPromegaのWizardカラムも好きですね。 いつもmidiprepするのはコスト的にももったいないと思います。大量に必要でない限りは。

(無題) 削除/引用 No.1196-16 - 2012/11/28 (水) 22:16:35 - 自信なし KYさん ありがとうございます。 大変驚いています。自分の不勉強を痛感しておりお恥ずかしい次第です。 そうなのですね、2 mlから取れるのですか。いつもは100-200 mlの液体培養から100-200 ugのplasmidを得ていました。（キアゲンさんのplasmid extractionカラムを使用） では、一度plateで得られたコロニーを一つpickして、再度plateにまいてみます。 ちなみに細胞へtransfectionするplasmidのpurityのグレードはどうしたらよいでしょうか？ いつものminiprepは自分の手で、P1, P2, P3を順次加えて、その後フェノクロ抽出、エタチンです。ですが、このグレードではtransfectionに充分ではないですよね？（以前、これで調製したplasmidをtransfectした時、ほぼポジコンのGFP陽性細胞がいませんでした。理由はわかりませんが、エンドトキシン等が入っているからなのかなと思っています。。） この場合のminiprepはキアゲンさんなどのsmall scaleのカラムを使うべきなのでしょうか？ すみませんこの辺り精通しておりません。どうかご教示いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1196-15 - 2012/11/28 (水) 21:51:15 - KY > > 実はたまにさんがご提示されたことで何がわかるのか自分は理解していませんでした。 > KYさんにもおなじことを言われ驚いているところです。 > > つまり、拾ったシングルコロニーをplate上で再度増やして、それをminiprepするということですね。確かにこの方法でsequencing等までは行けるでしょうが、実際の実験に使うために100 ml程度の液体培養を経てでないとmidiprepでplasmidを回収できませんよね？根本的な解決にはならないのではと思うのですが、すみませんがなぜこの方法をおすすめされるのか、その意図を教えてくださいませんか？不勉強で恐縮です。 > > 一般的には2ml培養のミニプレップでトランスフェクションするプラスミド量が取れるはずですが。 通常5-50ugぐらいは取れますよね？ 以前のラボでは、プラスミドを新しく増やす場合は50ulのコンピにトランスフォーム後、プレートにまき、それを全部かきとって、ミニプレップすればだいたい20-30ugとれてました。（シングルコロニーをとるのがお作法だとは思いますが） 今回のようなコロニーから直接だと、プレートにまける量は少なくなるかもしれませんが、一度プラスミドが取れれば、コンピにトランスフェオームして、再度プレートだけでミニプレップするための量は得られます。 midiprepと同じくらいの量はちょっと得にくいかもしれませんが、10cm dish復数回分のDNAなら十分この方法で得られます。

(無題) 削除/引用 No.1196-14 - 2012/11/28 (水) 21:24:54 - 自信なし >[Re:13] KYさんは書きました : > >[Re:2] たまにさんは書きました : > > 私なら、1プレートを３分割して（しなくてもよい）、それぞれのコロニーをプレートに広げます。１夜培養して、かきとって、ミニプレップでプラスミドの状態がどうなるかを見ます。液体培養でだけ増えないというのはたまに聞きますね。 > > たまにさんがおっしゃっているように、液体培養をせずに、コロニーをピックして、さらにプレートで線画培養もしくは50ulぐらいにケンダクしてからプレートに巻き直して培養してみてはどうでしょう。プレートで培養後、１mlぐらいの水をプレート上に加えて、アガロースを書き取らないように書き取ることができます。 KYさんありがとうございます。 実はたまにさんがご提示されたことで何がわかるのか自分は理解していませんでした。 KYさんにもおなじことを言われ驚いているところです。 つまり、拾ったシングルコロニーをplate上で再度増やして、それをminiprepするということですね。確かにこの方法でsequencing等までは行けるでしょうが、実際の実験に使うために100 ml程度の液体培養を経てでないとmidiprepでplasmidを回収できませんよね？根本的な解決にはならないのではと思うのですが、すみませんがなぜこの方法をおすすめされるのか、その意図を教えてくださいませんか？不勉強で恐縮です。

(無題) 削除/引用 No.1196-13 - 2012/11/28 (水) 21:11:57 - KY >[Re:2] たまにさんは書きました : > 私なら、1プレートを３分割して（しなくてもよい）、それぞれのコロニーをプレートに広げます。１夜培養して、かきとって、ミニプレップでプラスミドの状態がどうなるかを見ます。液体培養でだけ増えないというのはたまに聞きますね。 たまにさんがおっしゃっているように、液体培養をせずに、コロニーをピックして、さらにプレートで線画培養もしくは50ulぐらいにケンダクしてからプレートに巻き直して培養してみてはどうでしょう。プレートで培養後、１mlぐらいの水をプレート上に加えて、アガロースを書き取らないように書き取ることができます。

(無題) 削除/引用 No.1196-12 - 2012/11/28 (水) 20:25:29 - 自信なし >[Re:10] 虫の息さんは書きました : > コロニー数が多いのはTOPOベクターのコンタミでは。 虫の息さんありがとうございます。 insertはTOPOベクターから切り出した後、gelから抽出していますので、Topo vectorのコンタミは考えにくいと思っています。。

(無題) 削除/引用 No.1196-11 - 2012/11/28 (水) 20:24:27 - 自信なし >[Re:9] おおさんは書きました : > コロニーの数がおおいということですが、ライゲーションにつかったプラスミドの量はいくらでしょうか? おおさんありがとうございます。 推奨が50 ngだったかと思いますが、15 ngで行っています。 これでもうんと減らしている（0.008 pmol）つもりなのですが、まだ減らせそうですね。 ただ、、これまではこの量とこの方法でtransformするとほぼ確実insertが入っていて、コロニーも50-100程度は出ていたのです。

(無題) 削除/引用 No.1196-10 - 2012/11/28 (水) 13:08:38 - 虫の息 コロニー数が多いのはTOPOベクターのコンタミでは。 TOPOベクターを普段使わないのでよくわかりませんが、カタログによるとamp耐性をもっていそうなので。

(無題) 削除/引用 No.1196-9 - 2012/11/28 (水) 12:55:57 - おお コロニーの数がおおいということですが、ライゲーションにつかったプラスミドの量はいくらでしょうか?ばあいによっては極端に減らしてもいいかと思います。たとえば、大腸菌に複数のプラスミドがはいったとき大腸菌がふやすのにらくなプラスミドをせんたくしてしまいます。つうじょう数十ナノぐらいつかうかとおもいますし、それがだめなプロとコールとはいいませんが、一から五ナノグラムぐらいあれば十分コロニーがはえるはずです(コンピテントがコンストラクトをつくるのに十分なCFUをもってれば)。

(無題) 削除/引用 No.1196-8 - 2012/11/28 (水) 11:55:03 - 自信なし おおさん ありがとうございます。 > イーストは実験で使うやつでなくって、常在菌とかそこら中にいるやつのことです。ふつうは多少こんたみしても、増殖スピードがはるかに遅いのできになりませんが、極端にこんたみしてるとめだってくるかもと、、、 なるほど。 増殖スピードがはるかに遅い、とのことですが、 ligation産物をDH5αにtransformして、LA plateにまくと9-12時間あたりでコロニーはいつも通り出来てきます。特にminorなコロニーがジワジワ増え出す印象はありません。。 insertはマウスの栄養代謝に関与する酵素です。 情けない事にどう手を打てば良いのか皆目検討もつきません。 ちなみに同じ現象が前回も起きていて（この時はretrouirus vectorのbackboneもinsertも違います。）、その際はStbl3にtransformして、30度で培養してなんとかcloningできました。 今回もしてみたのですが、上手く行っていません。（今もう一度トライしています。）

(無題) 削除/引用 No.1196-7 - 2012/11/28 (水) 11:40:35 - おお >[Re:6] 自信なしさんは書きました : > > 当方labでは酵母を使用されている方はいらっしゃいますが、phageはいません。 イーストは実験で使うやつでなくって、常在菌とかそこら中にいるやつのことです。ふつうは多少こんたみしても、増殖スピードがはるかに遅いのできになりませんが、極端にこんたみしてるとめだってくるかもと、、、

(無題) 削除/引用 No.1196-6 - 2012/11/28 (水) 11:34:55 - 自信なし >[Re:4] おおさんは書きました : > わたしもイーストとかどこかに潜んでたんではないかとかなんとなく思ってましたけど、、、 > 誰か周りでファージつかってたりしてませんか。。。 おおさん コメントありがとうございます。 これまでpMXs系やpMEI-5系のレトロウイルスベクターを使って、insertを入れたものを10個程度コンストラクションしてきましたが、このような経験は２度目です。しかも一番最近に立て続けに２度起きています。 LA plateも作り直しましたし、他の方はレトロウイルスベクターではないにしろ、コンストラクションは問題なくできている様子です。 TA cloningでは問題ないので、やはりレトロウイルスベクターへligationしたから何かが起きている気がします。 当方labでは酵母を使用されている方はいらっしゃいますが、phageはいません。 plateに生えて来た大腸菌の色もいつもの色ですし、ただ、コロニーの数が以上に多いですが、、 一応、バクテリアなどのコンタミを考え、Topo vectorにinsertを入れたものからminiprepして、PEG沈して、sequencingして、余ったPEG沈サンプルをDH5αにtransformし直して、再びminiprepしたものからEcoR1/Not1でdigestしています。

(無題) 削除/引用 No.1196-5 - 2012/11/28 (水) 11:27:13 - 自信なし >[Re:3] KYさんは書きました : > > > insertを入れたプレートからは10E4ほどのコロニーが出ました。（これもちょっといつもに比べて異常に多い気がします。。） > > もしかしてバクテリアのコンタミがあるのではないでしょうか？コロニーの色がいつもよりもより白いとか、むしろ薄い白色しているとかありませんか。 KYさん コメントありがとうございます。 insertを入れなかったものではコロニーはほとんど（20個程度）生えなかったのでバクテリアのコンタミは考えにくいと思いたいところです。 色も大腸菌のような色でいつもと変わらないように思えます。 この液体培養を24hrs以上37°Cで回し続けるとようやく増えてきますが、miniprepしてもからっぽです。なにが増えて来ているのでしょうか。Ampが消費されたことで静菌していたものが増え出すのか… 原因が分からず、打開策も見えず困惑しております。 とりあえず、plateに生えて来たものをコロニーPCRを行うことはしてみます。

(無題) 削除/引用 No.1196-4 - 2012/11/28 (水) 09:37:31 - おお わたしもイーストとかどこかに潜んでたんではないかとかなんとなく思ってましたけど、、、 誰か周りでファージつかってたりしてませんか。。。

(無題) 削除/引用 No.1196-3 - 2012/11/28 (水) 07:55:05 - KY > insertを入れたプレートからは10E4ほどのコロニーが出ました。（これもちょっといつもに比べて異常に多い気がします。。） もしかしてバクテリアのコンタミがあるのではないでしょうか？コロニーの色がいつもよりもより白いとか、むしろ薄い白色しているとかありませんか。

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