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メチレンブルーでDNAが染色されない トピック削除
No.11975-TOPIC - 2023/12/05 (火) 00:02:50 - みずばしょう
いつも参考にさせていただいております。

現在、一部がビオチン化されたDNAをドットブロットによりナイロンメンブレンに吸着させた後、アビジンHRPを用いてビオチンを検出する実験を行っております。
スポットしたDNA量が同じであることを示すため、メチレンブルーを用いてDNAを染色しています。

アビジンHRPは良好に検出できているのですが、メチレンブルー染色のシグナルがほとんど検出できておりません。
メンブレン全体が均一に青くなってしまい、水で洗浄しても全体的に青色が薄くなるだけで、DNAをスポットしたところにシグナルが見られません。

簡単にプロトコルを記載いたしますので、メチレンブルー染色のテクニックや、代替となるDNA染色試薬などございましたら、ご教示いただけますと幸いです。

@ナイロンメンブレン（Zeta probe membrane, Bio-Rad)に100 ngのDNAをスポットする（25 ng/μLの溶液を2 μL×2回滴下する）
A250 nm UVを2分間照射しDNAをメンブレンにクロスリンクさせる
Bブロッキング、アビジンHRP添加、洗浄、HRP substrate添加を経てビオチンを検出する
Cメチレンブルー染色液（0.02%メチレンブルー/0.3M酢酸ナトリウム溶液）にメンブレンを浸し、シェイカーで揺らしながら30分間〜一晩反応させる
D蒸留水で３〜５回洗浄する

よろしくお願い申し上げます。
　
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ありがとうございます！ 削除/引用
No.11975-6 - 2023/12/05 (火) 20:16:54 - みずばしょう
皆様、早速ご意見を下さり誠にありがとうございます。

ご助言に従い、ブロッキング前にメチレンブルー染色を行ったところ、
DNAのシグナルが確認されました！
G25さまが仰るように、これまではブロッキング剤も染めてしまっていたようです。

＞必要がもし無いなら、DNA染色用の蛍光色素にかえたらいかがでしょうか？
EtBr染色を試してみたのですが、残念ながらほとんどシグナルが見えませんでした…
もし、おすすめの蛍光色素などございましたらご教示いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用
No.11975-5 - 2023/12/05 (火) 07:24:16 - G25
ブロッキング剤なども染まってしまうから。
きれいなメンブレンにDNAだけが載っていないと難しいと思います。
ノーザン/サザンブロットでマーカーを染めるときも、ブロット後、ハイブリなど先の処理をしてからじゃ染色はうまくいかない。
順序を入れ替えて先にメチレンブルー染色体をしてはいかが。
メチレンブルー染色は非破壊的で、サザン／ノーザンブロットで転写直後にを染めて全核酸やマーカーの観察してからハイブリに持っていくこともできます。ウェスタンブロットにおけるポンソーS染色のように。

(無題) 削除/引用
No.11975-4 - 2023/12/05 (火) 05:04:07 - おお
>[Re:3] あのさんは書きました :
> メチレンブルーにこだわる必要がありますか？
>
> 必要がもし無いなら、DNA染色用の蛍光色素にかえたらいかがでしょうか？

Sybr SafeやEtBrとかで染めてみたけど意外とうまく行かないんだなぁ。ノーザンでEtBr使うことはあるようだけど、あんまりきれいな画像が取れない。

なにかおすすめの色素がありますでしょうか。私はPCR産物をPositive chargedのナイロンにトランスファーし、PCR産物はわざとサイクル数を抑えているので見れないですけど、マーカーはメチレンブルーで染めています。

(無題) 削除/引用
No.11975-3 - 2023/12/05 (火) 03:59:32 - あの
メチレンブルーにこだわる必要がありますか？

必要がもし無いなら、DNA染色用の蛍光色素にかえたらいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.11975-2 - 2023/12/05 (火) 00:57:29 - おお
Bブロッキング、アビジンHRP添加、洗浄、HRP substrate添加を経てビオチンを検出する
の前に染色すればどうでしょう。

メチレンブルーでDNAが染色されない 削除/引用
No.11975-1 - 2023/12/05 (火) 00:02:50 - みずばしょう
いつも参考にさせていただいております。

現在、一部がビオチン化されたDNAをドットブロットによりナイロンメンブレンに吸着させた後、アビジンHRPを用いてビオチンを検出する実験を行っております。
スポットしたDNA量が同じであることを示すため、メチレンブルーを用いてDNAを染色しています。

アビジンHRPは良好に検出できているのですが、メチレンブルー染色のシグナルがほとんど検出できておりません。
メンブレン全体が均一に青くなってしまい、水で洗浄しても全体的に青色が薄くなるだけで、DNAをスポットしたところにシグナルが見られません。

簡単にプロトコルを記載いたしますので、メチレンブルー染色のテクニックや、代替となるDNA染色試薬などございましたら、ご教示いただけますと幸いです。

@ナイロンメンブレン（Zeta probe membrane, Bio-Rad)に100 ngのDNAをスポットする（25 ng/μLの溶液を2 μL×2回滴下する）
A250 nm UVを2分間照射しDNAをメンブレンにクロスリンクさせる
Bブロッキング、アビジンHRP添加、洗浄、HRP substrate添加を経てビオチンを検出する
Cメチレンブルー染色液（0.02%メチレンブルー/0.3M酢酸ナトリウム溶液）にメンブレンを浸し、シェイカーで揺らしながら30分間〜一晩反応させる
D蒸留水で３〜５回洗浄する

よろしくお願い申し上げます。
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