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(無題) 削除/引用 No.12011-19 - 2023/12/19 (火) 05:43:59 - おお 後染めCBBは実際にやっている人もいましたし、染色はできるものと思ってます。どれくらいうまくいくのかはよくわかりませんけど。注意点はニトロセルロースではCBBの吸着性が高いので難しいです。 ＞なお、CBBを用いたこの染色は抗体反応の前に行うことはできません、あくまでも全部終わった後に行います。 そう言う話は聞きますが、BNPAGEでWBするときは一面にCBBが吸着します。メタノールで脱色後WBすることになります。おそらく通常のWBでもできなくはないのでは？

(無題) 削除/引用 No.12011-18 - 2023/12/18 (月) 11:51:19 - U Blockingはskim milkが主ですが、たまにBSAでやってたこともあります。いずれもバックグラウンドの問題を感じたことないです。バックグラウンドは正確には真っ白でなくてごく薄く青い感じもしますがバンドの青との差異は歴然としてます。ブロッキング剤は洗いの過程でかなりとれるのか、電気的に転写していないので結合がゆるいのかなあとおもいました。 PVDFメンブレンのCBB染色は大学生の時からみんなやってたので相当昔からあるかなりスタンダードな方法と思ってました。 ポンソー染色はもっと昔、たぶんまだニトロセルロース膜が主流だった時代とおもいます。もちろん転写後に抗体反応前に転写状況を確認するにはいまでもよい方法とおもいます。

(無題) 削除/引用 No.12011-17 - 2023/12/18 (月) 09:29:10 - G25 >ImmunoblottingしたあとはPVDF膜をCBB-R250ーメタノールー酢酸混合液で染色し、そのあとメタノール酢酸混合液で脱色してます。 ブロッキング剤の染色によるバックグラウンドは問題になりませんか。 ブロッキング剤はなにを使っているんでしょ。

(無題) 削除/引用 No.12011-16 - 2023/12/17 (日) 19:09:28 - U ポンソー（SまたはR)やアミド黒は感度が低いです。 ImmunoblottingしたあとはPVDF膜をCBB-R250ーメタノールー酢酸混合液で染色し、そのあとメタノール酢酸混合液で脱色してます。感度的にはポンソーやアミド黒よりは高く染色像もきれいです。酢酸を使わない方法（アミノ酸配列決定をする場合位にで末がブロックされるのを避けるために、昔そうしていた時代があったことによるとおもわれます））もありますが、使ったほうが鮮明な染色像がえられます。 バックグラウンドがまだ青いうちに脱色を止めて水で数回軽くあらってから放置して自然乾燥させます。（バックが白くなるまで脱色してると、バンドも脱色されてくるので注意）乾くと、バックグラウンドの青が減って白くなり、ぬれてるときは見えなかったマイナーなバンドも鮮明に見えてきます。 なお、CBBを用いたこの染色は抗体反応の前に行うことはできません、あくまでも全部終わった後に行います。

(無題) 削除/引用 No.12011-15 - 2023/12/17 (日) 09:38:30 - おお ゲルをDuplicateして、一方はゲルの状態でCBBで染めるというのもありだと思いますけどね。

(無題) 削除/引用 No.12011-14 - 2023/12/16 (土) 20:50:42 - Ponceau ＞蛍光撮影装置があればSYPR　Rubyで染めるのが良いと思う。 ＞あるいは転写前のゲルをSYPR　Orange染色で撮像しておくとか。 ラボの財政的に、レーンのノーマライズのためだけに試薬を買ってくれとは言いにくい雰囲気なんですよね。GAPDHでいいと言われそうですが、ピューロマイシンの取り込み実験（新生ペプチド標識）なので総蛋白量で割るのがいいです。 ＞ポンソーって、みるみるうちに脱色されていきますよね。 そうですね。前のラボで使っていたニトロセルロースメンブレンはどこのメーカーのものか忘れましたが硬いしっかりしたもので、ポンソーの脱色も緩やかでした。

(無題) 削除/引用 No.12011-13 - 2023/12/16 (土) 20:42:36 - Ponceau >カラーでとっているなら、赤をカットしてやればコントラストつくしやりやすいと思いますが、バックグランドも同じ挙動を示すので解決にはならないですね、、、 >画像取得の段階で、RGBで画像を取得するよりも16-bit grayでスキャンするほうが測定に良いと思います。 この二つは整合するのかわかりませんが、次回16ビットグレイでスキャンしてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12011-12 - 2023/12/16 (土) 10:53:26 - LPS ポンソーって、みるみるうちに脱色されていきますよね。膜の領域部分毎でも脱色具合が均一でないので、定量にはあんまり適してないのではないかと。大雑把な確認ぐらいにしか使っていませんが。

(無題) 削除/引用 No.12011-11 - 2023/12/16 (土) 07:00:15 - qq ＞＞どんな画像からバックグラウンドを差し引こうとしているのでしょうか？ ＞ImageJでRGBを８ビットグレイ画像にしたものを使っています。 RGBをRGB−stackにすると、Greenが主要な対応チャンネルでしょう。（赤というよりマゼンタに近い） そうであれば、Greenチャンネルだけを対象にして測定するほうが良いです。 画像取得の段階で、RGBで画像を取得するよりも16-bit grayでスキャンするほうが測定に良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.12011-10 - 2023/12/16 (土) 03:33:40 - おお カラーでとっているなら、赤をカットしてやればコントラストつくしやりやすいと思いますが、バックグランドも同じ挙動を示すので解決にはならないですね、、、 ちょっと手間になるけど、測定誤差がある程度に収まるなら、染色してイメージをとる、脱色して染色し直すを３回ほど繰り返して平均（これは統計的には実際の値の近似値）を取るというのもできなくもない。 この手の染色で使われる色素は蛍光を除けばPonceauの他にアミドブラック、Fast green、CBBといったところらしい。アミドブラックは脱色に難があり（場合によっては膜が歪む）、WB検出後にやるのがベターらしい。CBBはNCでは使えないが、コロイダルのやつはどんな感じかわからない。Fast greenがPonceauの代わりに使えそうな気がするが経験がないのでなんとも言えない。 蛍光色素を使う方法は割愛するが、タンパク自身２８０EX/３５０EMの蛍光を持っているので適切なフィルターがあれば直接見れなくもない（多分感度は非常に低いと思う）。trichloroethanol やTCAで蛍光が増強できるそうで、バイオラッドはゲルにtrichloroethanol （だと思う）を加えたものを売っている。 https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/510/288/ps1200en00.pdf https://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/total-protein-detection?ID=LUSQ3K15

(無題) 削除/引用 No.12011-9 - 2023/12/15 (金) 21:14:25 - Poceau みなさま、アドバイスをありがとうございます。 ＞いっそのことバックグラウンドを引かないといった方法を聞きました。 もしこれが許容されるのであれば、この方法での定量結果が一番視認時と近く感じます。 ＞バックグラウンドの出方によってどうバックグランドを引くのか決めるべきで、それがわからないのにこうするといいというのはちょっと難しいし、どのように測定しているのかにもよるし。 サンプルを泳動しないブランクレーンをバックグラウンドにしています。レーン間あるいはレーンの上下で濃くそまるところと比較的薄く染まるムラができてしまいます。 染色後、脱線せずに水気を除いてスキャンも試しましたが、ポンソーののりが良い部分を悪い部分があって均一に染色されてないです。 ニトロセルロースメンブレンを使っていますが、そもそもS／N比が低いです。 ＞ImageJ ImageJとImager付属ソフトの両方を試しましたが、目で見た時と大きなずれ（定量するとレーン間で最大２倍以上のばらつき）がありました。 ＞どんな画像からバックグラウンドを差し引こうとしているのでしょうか？ ImageJでRGBを８ビットグレイ画像にしたものを使っています。

(無題) 削除/引用 No.12011-8 - 2023/12/15 (金) 14:26:24 - G25 特定のバンドの強度ではなく、レーン全体の積分ということですか。 染色強度が強くなくS/Nの低いPonceau Sでは難しいかも。 蛍光撮影装置があればSYPR　Rubyで染めるのが良いと思う。 https://www.lonzabio.jp/catalog/1502/ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/jp/ja/S11791 あるいは転写前のゲルをSYPR　Orange染色で撮像しておくとか。

(無題) 削除/引用 No.12011-7 - 2023/12/15 (金) 12:12:36 - qq どんな画像からバックグラウンドを差し引こうとしているのでしょうか？ 白地にピンクのRGB画像をそのままバックグラウンド差し引きをしているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12011-6 - 2023/12/15 (金) 08:54:07 - ああ 私はHRP-conjugateをUVで撮影したものでしかやったことないですが、imageJようにバンド強度の定量マクロを使ってました。 https://www.protocols.io/view/quantification-of-gel-bands-by-an-image-j-macro-ba-bp2l6n4bkgqe/v1

(無題) 削除/引用 No.12011-5 - 2023/12/15 (金) 08:50:05 - TS わたしはImage Jでやってます。手作業ですが、バックグラウンド（ベースライン）目で確認しながらで、特に問題を感じたことはないです。通常のサンプル数なら作業自体も時間はかかりません。

(無題) 削除/引用 No.12011-4 - 2023/12/15 (金) 08:25:30 - おお >視認した感覚とかなりズレた値が出てしまいます。 バックグランドがあると目で見る感覚のほうが実際の量の違いからズレていることもありますので、見た目の違いが正しいとも限らないと思いますが、、、 バックグラウンドの出方によってどうバックグランドを引くのか決めるべきで、それがわからないのにこうするといいというのはちょっと難しいし、どのように測定しているのかにもよるし。 比較的均一なバックグランドであれば、泳動のレーンのあるところより上と下（タンパクが乗ってないところ）の部分でバックグランドを設定するといいかもしれません。レーンのクロマトがあるなら、その一番低い値のところからフラットにバックグランドを引く。バンドを囲っているなら、ブロッティングされてない部分を数カ所指定してその平均のIntensityをバックグランドにするとか。

(無題) 削除/引用 No.12011-3 - 2023/12/15 (金) 06:33:08 - あの ポンソーではなく、蛍光色素のRevert700を使ってオデッセイでスキャンした場合の経験ですが、 似たようなことになることはあります。 メーカーのサポートに相談したら、バックグラウンドの計算方法を工夫するとか、いっそのことバックグラウンドを引かないといった方法を聞きました。

(無題) 削除/引用 No.12011-2 - 2023/12/15 (金) 02:34:03 - Ponceau 誤：ウェスタンのシグナルをポンソー染色で定量したいのですが 正：ウエスタンのシグナルをレーン間でノーマライズするためポンソー染色でレーン上の蛋白質を定量したいのですが

ポンソー染色の定量 削除/引用 No.12011-1 - 2023/12/15 (金) 02:32:18 - Ponceau ウェスタンのシグナルをポンソー染色で定量したいのですが、スキャンしてイメージソフトでバックグラウンドを差し引くと、視認した感覚とかなりズレた値が出てしまいます。レーン間で染色に差があまりないように見えるのですが、染めむらがあるためか、バックグラウンドを引くステップでおかしくなってしまうようです。みなさまはどのように定量されていますでしょうか？

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