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IP前後で分子量が変わる トピック削除
No.1205-TOPIC - 2012/11/30 (金) 15:52:50 - SS
いつも勉強させて頂いてます。
現在困っていることに関して何かご意見が頂けたらと思いトピックを作成させて頂きました。

現在分子Aと分子Bの結合を免疫共沈で確認しています。

手順は、FLAG-分子A、V5-分子Bといったタグ付のタンパクをHEK293Tに発現させ、cell lysateそのままとcell lysateをFLAG抗体でIPした後に溶出させたサンプルをそれぞれウエスタンで見ています。

その結果、V5-分子Bのバンドはcell lysateでもIP後のサンプルでも同じ分子量の位置に確認できました。

ところがFLAG-分子Aのバンドはcell lysateとIP後で異なる分子量にバンドが出現してしまいました。cell lysateの場合が80kDaくらいだとすると、IP後が120kDaくらいです。

FLAG-分子AとV5-分子Cとで同じプロトコルでIPを行った時にはこのような現象は認められませんでした。

FLAG-分子Aを発現させていないネガコンではcell lysateでもIP後でもバンド出ないことからIP前後で分子量の変わるバンドはFLAG-分子Aを見ているものだと思います。

泳動前で同じバッファー（SDS、TritonX、2ME入り）で同じ処理（95℃ 5分）をしているのでIP前とIP後で変わることといったらIP用抗体の持ち込みと総蛋白量くらいだと思います。

FLAG-分子Aが凝集するのであればIP前でも多少は大きい分子量（120kDa）のバンドが見えそうですが、全くありません。

IP用抗体とcell lysateとの反応時間も1時間程度です。

この分子量の変化をどのように解釈したらいいのでしょうか？

ご教示の程お願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.1205-14 - 2012/12/06 (木) 14:31:44 - おお
少し私の頭の中が整理がつかないですが、とにかく結合には関係がなさそうなので、結合のためのデーターとしては言及するひつようもないかとおもいます。

FLAG IPでサイズが違うものがでるのは、ネガコンを適切にとり、スペシフィックなバンドであるか確認されるとよいと思います。FLAG IPで従来のサイズと大きいサイズ両方見れるわけですよね。。。

(無題) 削除/引用
No.1205-13 - 2012/12/06 (木) 12:32:56 - SS
経過を報告させて頂きます。

おお様にご指摘頂いたようにV5-分子BからIPをしてみたところ、不思議なことにFLAG-分子Aの分子量はIP前後で変わりませんでした。

FLAG-分子Aとanti-FLAG M2 agaroseの反応の過程に問題があるのかもしれません。
もしくはIPによって過剰に濃縮されたFLAG-分子Aでなにかが起こっているのかもしれません。

また何か気になる点がございましたらご指摘ください。

(無題) 削除/引用
No.1205-12 - 2012/12/04 (火) 12:26:03 - SS
＜中年様
回答ありがとうございます。

FLAG-分子Aの分子量は約80kDaです。
FLAG-mockやFLAG-他分子と並べてFLAG-分子AをSDS-PAGEして発現を確認したことがありますが、80kDaのバンドはFLAG-分子Aで良さそうです。

現在はV5-分子BでIPしてみてIP後のFLAG-分子Aの分子量がどのように変化をするか検討中です。
明日〜明後日にかけて結果をご報告できると思います。

(無題) 削除/引用
No.1205-11 - 2012/12/03 (月) 22:28:44 - 中年
FLAG-分子Aの計算上のサイズはどのくらいですか？80kD？120kD？

120kDなら、total lysateで見えているバンドがFLAG-分子Aではなくて抗体がクロスしているだけということはありませんか。IPで濃縮して初めてバンドが出るという意味です。

(無題) 削除/引用
No.1205-10 - 2012/12/03 (月) 21:22:58 - SS
本日追加で実験を行ったところ、FLAG-分子AのみをIPしても分子量が増加していることが判明しました。

結果的に助言を求めておきながら皆様をミスリードしてしまうような情報を提示してしまい申し訳ありませんでした。

本日の結果からIPの操作自体の中で何らかの現象が起きていると考えられました。

＜qq様
1）IPは
@6wll dishに捲いたHEK293T細胞にFLAG-分子A±他分子をトランスフェクション
A24時間後に回収し100mlのRIPA（SDS抜き）で懸濁・遠心して上清をcell lysateとしています。この内5μlを等量の2×sample bufferと混ぜウエスタンのサンプルにしています。
B残りのcell lysateをsigmaのanti-FLAG M2 affinity gel 5〜10μlと混合して4℃　1〜2時間転倒混和
C転倒混和後にaffinity gelを300μlのRIPA（SDS・Triton抜き）で4回洗浄
D溶出はaffinity gelの上清を27G 注射針で十分に取り除いた後に10μlのRIPA＋15μlの2×sample bufferを加えた後に95℃ 3分加熱して上清10μlをIPサンプルとしてウエスタン
といった手順で行っています。

2）IP前のサンプルでは120kDaのバンドが全く出ませんのでIPの過程に問題があるのだと思います。ご指摘の通り、IP後のaffinity gelに結合していない分画を解析したいと思います。

3）市販のanti-FLAG M2 affinity gelを用いているので抗体なしのものは難しいかもしれませんが、protein G-agarose gelは手持ちにあるためこれを代替として抗体なしの場合の分子Aの動向を確認したいと思います。

貴重なご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1205-9 - 2012/12/03 (月) 11:16:04 - qq
＞cell lysateそのままとcell lysateをFLAG抗体でIPした後に溶出させたサンプルをそれぞれウエスタンで見ています。

１）「溶出させた」がアヤシイです。どうやって溶出させているのでしょうか？
EDTA+Flag-peptideでしょうか？
２）いつどこで80kDaから120kDaになったと思いますか？
IPされなかった画分をできるだけ網羅できるようにウェスタンしてみるといかがでしょうか？
３）抗体なしでIP操作をした素通りには80kDaでしょうか120kDaでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1205-7 - 2012/12/02 (日) 08:39:29 - SS
＜おお様

ご回答ありがとうございます。

当初は実験的なミスによるものを第一に考えていましたが、タンパク機能に関係する可能性も出てきたので、もう少しつっこんで検討していきたいと思います。
現在条件を変えながら検討しているところです。追って結果をご報告させて頂ければと思います。

(無題) 削除/引用
No.1205-6 - 2012/12/01 (土) 06:27:51 - おお
>[Re:5] SSさんは書きました :
> ＜おお様

> IP後のみで分子量が変わるというのはやはりIPすることでSDS-PAGEの泳動に影響を与えている何かが起きていると考えた方が妥当なのでしょうか？
>
> 引き続き皆様にご意見賜りたいと思います。

IPのフラクションはライセイトのフラクションのごく一部を見ているわけですから、ライセイトのフラクションのマジョリティは結合している状態のフラクションの状態を反映していないかもしれません。

結合に何かの修飾が必要だとか、結合のあとに速やかに修飾されるということがあるのかもしれませんし、大変面白いと思っています。

糖鎖修飾とか、リン酸かなら酵素でもとの位置に戻すことができるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用
No.1205-5 - 2012/12/01 (土) 04:57:35 - SS
＜おお様

ご意見ありがとうございます。早速V5側からのIPも行ってみたいと思います。
当初はFLAG-分子AとV5-分子Bが不可逆的な結合をしているのかとも考えたのですが、それならばIP前でもFLAG-Aの分子量が大きい方へシフトするはずですよね。
IP後のみで分子量が変わるというのはやはりIPすることでSDS-PAGEの泳動に影響を与えている何かが起きていると考えた方が妥当なのでしょうか？

引き続き皆様にご意見賜りたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.1205-4 - 2012/12/01 (土) 00:53:53 - おお
V5ー分子Bによる、ちょくせつ、またはかんせつてきしゅうしょく。

V5 IPでうらをとってみてはどうですか

(無題) 削除/引用
No.1205-3 - 2012/11/30 (金) 20:28:19 - SS
＜中年様

さっそくのレスポンスありがとうございます。

FLAG-分子AとV5-分子Cといった感じでBと異なる分子で同様の実験を行った際にはIP前後の分子量の変化は認めませんでした。

取り敢えず中年様のご指摘を受けて分子Bの濃度を徐々に変化させてIPを行った時にFLAG-分子Aの分子量の変化が分子Bの濃度と相関するか試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.1205-2 - 2012/11/30 (金) 19:48:35 - 中年
分子Ｂが存在しない条件でも同じことが起こりますか？つまり、FLAG-分子Ａのみを発現させた場合、IP前後で泳動度が変わるでしょうか。

IP前後で分子量が変わる 削除/引用
No.1205-1 - 2012/11/30 (金) 15:52:50 - SS
いつも勉強させて頂いてます。
現在困っていることに関して何かご意見が頂けたらと思いトピックを作成させて頂きました。

現在分子Aと分子Bの結合を免疫共沈で確認しています。

手順は、FLAG-分子A、V5-分子Bといったタグ付のタンパクをHEK293Tに発現させ、cell lysateそのままとcell lysateをFLAG抗体でIPした後に溶出させたサンプルをそれぞれウエスタンで見ています。

その結果、V5-分子Bのバンドはcell lysateでもIP後のサンプルでも同じ分子量の位置に確認できました。

ところがFLAG-分子Aのバンドはcell lysateとIP後で異なる分子量にバンドが出現してしまいました。cell lysateの場合が80kDaくらいだとすると、IP後が120kDaくらいです。

FLAG-分子AとV5-分子Cとで同じプロトコルでIPを行った時にはこのような現象は認められませんでした。

FLAG-分子Aを発現させていないネガコンではcell lysateでもIP後でもバンド出ないことからIP前後で分子量の変わるバンドはFLAG-分子Aを見ているものだと思います。

泳動前で同じバッファー（SDS、TritonX、2ME入り）で同じ処理（95℃ 5分）をしているのでIP前とIP後で変わることといったらIP用抗体の持ち込みと総蛋白量くらいだと思います。

FLAG-分子Aが凝集するのであればIP前でも多少は大きい分子量（120kDa）のバンドが見えそうですが、全くありません。

IP用抗体とcell lysateとの反応時間も1時間程度です。

この分子量の変化をどのように解釈したらいいのでしょうか？

ご教示の程お願いいたします。
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