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HUVECのスタベーション条件について トピック削除
No.12080-TOPIC - 2024/01/15 (月) 21:20:11 - はな
HUVECにox-LDLでの刺激と薬剤添加を行ったのち、RNA抽出、PCR(ICAM-1、VCAM-1など)を行う計画を立てています。現在の培養条件および質問は以下の通りです。vitro実験を最近始めたので、知識不足ですみませんが分かる方やHUVEC培養されてる方などいらっしゃいましたら、どうぞよろしくお願いします。

 培地:HuMedia-EG2(基礎培地Humedia-EB2+増殖因子キット)
    
    増殖因子キット
      ・FBS(最終濃度2%)
      ・hEGF
      ・ハイドロコーチゾン
      ・hFGF-B
      ・ヘパリン
      ・ゲンタイマイシン・アンフォテリシンB
 
 質問:スタベーションの条件はどれが適当でしょうか。
 @FBSを含む増殖因子全て(-)のHumedia-EB2でスタベーション。
 AFBSのみ入れたHumedia-EB2でスタベーション
 BFBS以外の増殖因子を入れたHumedia-EB2でスタベーション

 質問:スタベーションの時間はどれが適当でしょうか。
    ちなみに、薬剤およびoxLDLは24時間刺激する予定です。
    FBS0%だと24時間も細胞が耐えられず、困っています。
 
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17件 ( 1 〜 17 )  前 | 次  1/ 1. /1


皆様ありがとうございました。 解決済み 削除/引用
No.12080-17 - 2024/02/14 (水) 17:40:54 - はな
大変参考になりました。
色々試してみようと思います。

ご返信ありがとうございます。 削除/引用
No.12080-16 - 2024/02/14 (水) 17:39:09 - はな
FBS濃度や時間を少し工夫してみようと思います。
ありがとうございます。

>[Re:11] 渡辺さんは書きました :
> >[Re:1] はなさんは書きました :
> >  質問:スタベーションの条件はどれが適当でしょうか。
> >  @FBSを含む増殖因子全て(-)のHumedia-EB2でスタベーション。
> >  AFBSのみ入れたHumedia-EB2でスタベーション
> >  BFBS以外の増殖因子を入れたHumedia-EB2でスタベーション
> 通常のFBS2%の状態で刺激を入れても入れなくても遺伝子の発現の変化は見られなかったんですよね?細胞が死なない程度で、刺激あるなしであなたのターゲット遺伝子の変化が見られればいいわけです。ですので条件は1,2,3どれでもあなたの実験条件にあっていればいいわけです。具体的にどれがいいのかは刺激薬剤の作用機序とターゲット遺伝子によるので、そこはご自分で決めるか先輩や先生とディスカッションして決めて下さい。
>
> >  質問:スタベーションの時間はどれが適当でしょうか。
> >     ちなみに、薬剤およびoxLDLは24時間刺激する予定です。
> >     FBS0%だと24時間も細胞が耐えられず、困っています。
> FBS0%で24時間耐えられないなら少し時間を短くするかな、4時間とか。
> あるいはFBSを0.2%とか0.1%とかにして24時間かオーバーナイトか。

ご返信ありがとうございます。 削除/引用
No.12080-15 - 2024/02/14 (水) 17:37:30 - はな
先行論文まで載せていただきありがとうございます。
実際にいろいろな条件で試してみようと思います。何も情報がないところから始めるより、今回皆さんの体験談なども聞くことができたのでそれを参考に始めてみようと思います。

>[Re:7] おおさんは書きました :
> Cells were kept in endothelial cell basal medium
> (EBM, Promocell) supplemented with 1% FCS without growth factors before and during
> experiments. Cells between passage 2 and 4 were used for the experiments.
> DOI:10.1371/journal.pone.0160145
>
>
> We compared the response of subconfluent cells cultivated under serum starvation conditions for 72 hours in the absence or presence of increasing concentrations of VEGF, FGF-2, or PlGF. The annexin V-/PI- population represented the surviving cells. In the concentration range tested, a protective effect of each growth factor was seen in EPDCs as well as in HUVECs against serum starvation–induced cell death. This effect was 2-fold higher in EPDCs, whatever the growth factor used (Figure 5C).
> doi.org/10.1182/blood-2003-08-2770
>
> HUVECs were starved in endothelial cell basal medium (EBM)-2 (Cambrex) supplemented with 0.4% FBS for 24 h. HUVECs of passages 2–9 were used in the experiments.
> doi.org/10.1186/s40360-017-0169-y
>
> HUVEC were seeded in 12-well plates in regular medium and after 24 h growth factors and serum-starved overnight followed by treatment with VEGF and/or acacetin.
> doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-13-0209
> この条件で10%ぐらいは死んでいる。
>
> はっきり明記してないものもあるが、どういう系があなたの実験にベストなのかということもあるので論文を調べ上げるべきではないかと申し上げた次第です。血清を完全になくすのではなく若干の加えるというのも多いです。もしあなたがなにか論文を参考にしていて、はっきりとわからないところがあるなら著者に問い合わせてみるのが筋だと思います。色々バリエーションがあるなら、他に興味がある他の実験のアドバイスがどこまで役に立つかということです。以下のようなことはちょっとしたコツみたいなものではありません。はっきりさせておくべきことです。そこは著者に責任がある部分でもあるので聞くべきことでしょう。
>
> 質問:スタベーションの条件はどれが適当でしょうか。
>  @FBSを含む増殖因子全て(-)のHumedia-EB2でスタベーション。
>  AFBSのみ入れたHumedia-EB2でスタベーション
>  BFBS以外の増殖因子を入れたHumedia-EB2でスタベーション
>

ご返信ありがとうございます。 削除/引用
No.12080-14 - 2024/02/14 (水) 17:34:26 - はな
確かに、著者に問い合わせる必要はあるかと思いますので、連絡してみようと思います。私も血清飢餓なしでやってみようと思います。

>[Re:6] LPSさんは書きました :
> この手の論文は数多く出てるので、著者に直接問い合わせればいいです。
> 実験が再現できなくて困っていると書けば、かなりの率で返事がきます。
>
> Ox-LDLによる刺激ですが、2%牛胎児血清中に高濃度で入っているとも思えないので普通は飢餓に置く必要はないと思います。ただし、例えば使用する薬剤が2%の血清の影響を受けて不活化されてしまうなどがあれば別です。自分は基本的に、刺激による反応が見られるならば飢餓条件での実験は好みません。
>
> ついでながら、 LONZAのEGM-2での血清飢餓の状態(成長因子は抜かない)では、24時間は大丈夫です。血清抜きのメディウムで2回洗浄しているので、残存血清の影響(もともと2%ですが)は無視できると。
>
> スタベーションと言っても、実際にはserum starvation, glucose starvation等々あるので、注意。
>

ご返信ありがとうございます。 削除/引用
No.12080-13 - 2024/02/14 (水) 17:32:58 - はな
私も学会で聞いてみたことがあるのですが、同じように死にませんよと言われてしまいました。「もしかしたら、HUVECの性質が変わってしまっている物」を培養している可能性もあるのでは、と知人が言っていました。私としては、きちんと培養していれば、血清飢餓で48hは全部浮いてきたので、一度血清飢餓なしや、低血清でのスタベーションなど試してみたいと思います。
ためになる経験談やご助言をありがとうございました。

>[Re:4] HUVECさんは書きました :
> 補足の補足。
>
> 実際にHUVECを使った実験をやってる人で無いと、
>
> >先行論文では、「スタベーションを48時間行った」など簡単な文章がほとんど
>
> これが本当のことで、ビックリするほど詳細が書いてない論文だらけだなんて想像がつかないと思います。おおさんが「論文をあたれ」というのは確かに当然のレスではあるのですが、本当に書いてない論文だらけなんですよ。
>
> 以下、スタベーションの条件は(1)FBSと全てのgrowth factor抜きでの話になります。
>
> 学会で「24時間スタベーションの条件だとHUVECはかなり死ぬのでは?」という質問をしたところ、いや死にませんよで終了したことがあります。でも、実際きちんとスタベーションの条件においたら死にますよね?(少なくとも、細胞がshrinkしてまともな形態を保ってない)トピ主に同意します。もしかしたら、死んだ細胞が多数でもお構いなしでそのまま実験を続けている可能性もあるかと思います。
>
> スタベーション24時間の論文の著者が留学して来たので、24時間だと細胞かなり死んでない?と聞いたところ、実はスタベーションは行ってない、という返事でした。なんだそりゃ?
>
> で、以前は私はスタベーションを1時間という短時間で行っていました(その後の刺激が30分。AKTのリン酸化を見てました)。が、スタベーション有り無しで実験をしてみたところ大した違いが見られなかったので、その後はスタベーション無しで実験をしています。勿論論文にもスタベーションの記述は無しです。念のために書くと、最後のメディウムチェンジ(これ自体がgrowth factorによる刺激になる)から24時間以上待って実験しています。
>
> トピ主さんの実験条件でスタベーションが必須かどうかを確認してみるのも手だと思います。

ご返信ありがとうございます。 削除/引用
No.12080-12 - 2024/02/14 (水) 17:30:39 - はな
私も学会で聞いてみたことがあるのですが、同じように死にませんよと言われてしまいました。「もしかしたら、HUVECの性質が変わってしまっている物」を培養している可能性もあるのでは、と知人が言っていました。私としては、きちんと培養していれば、血清飢餓で48hは全部浮いてきたので、一度血清飢餓なしや、低血清でのスタベーションなど試してみたいと思います。
ためになる経験談やご助言をありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.12080-11 - 2024/01/31 (水) 11:17:03 - 渡辺
>[Re:1] はなさんは書きました :
>  質問:スタベーションの条件はどれが適当でしょうか。
>  @FBSを含む増殖因子全て(-)のHumedia-EB2でスタベーション。
>  AFBSのみ入れたHumedia-EB2でスタベーション
>  BFBS以外の増殖因子を入れたHumedia-EB2でスタベーション
通常のFBS2%の状態で刺激を入れても入れなくても遺伝子の発現の変化は見られなかったんですよね?細胞が死なない程度で、刺激あるなしであなたのターゲット遺伝子の変化が見られればいいわけです。ですので条件は1,2,3どれでもあなたの実験条件にあっていればいいわけです。具体的にどれがいいのかは刺激薬剤の作用機序とターゲット遺伝子によるので、そこはご自分で決めるか先輩や先生とディスカッションして決めて下さい。

>  質問:スタベーションの時間はどれが適当でしょうか。
>     ちなみに、薬剤およびoxLDLは24時間刺激する予定です。
>     FBS0%だと24時間も細胞が耐えられず、困っています。
FBS0%で24時間耐えられないなら少し時間を短くするかな、4時間とか。
あるいはFBSを0.2%とか0.1%とかにして24時間かオーバーナイトか。

(無題) 削除/引用
No.12080-10 - 2024/01/31 (水) 05:15:31 - おお
あと自身である程度条件自身の環境でベストな条件を探ることも重要です。

(無題) 削除/引用
No.12080-9 - 2024/01/31 (水) 05:12:40 - おお
論文を調べろといったのは意外とバリエーションがある様に感じたのも理由です。

(無題) 削除/引用
No.12080-8 - 2024/01/31 (水) 05:09:38 - おお
>[Re:4] HUVECさんは書きました :
> 補足の補足。
>
> 実際にHUVECを使った実験をやってる人で無いと、
>
> >先行論文では、「スタベーションを48時間行った」など簡単な文章がほとんど
>
> これが本当のことで、ビックリするほど詳細が書いてない論文だらけだなんて想像がつかないと思います。

なにか成書とかHUVECの特集を組んだような本、あるいはMethods in ...などの類のものが出てませんか?場合によってはProtocolに特化したような論文とかJOVEみたいなものとか。

(無題) 削除/引用
No.12080-7 - 2024/01/31 (水) 05:06:41 - おお
Cells were kept in endothelial cell basal medium
(EBM, Promocell) supplemented with 1% FCS without growth factors before and during
experiments. Cells between passage 2 and 4 were used for the experiments.
DOI:10.1371/journal.pone.0160145


We compared the response of subconfluent cells cultivated under serum starvation conditions for 72 hours in the absence or presence of increasing concentrations of VEGF, FGF-2, or PlGF. The annexin V-/PI- population represented the surviving cells. In the concentration range tested, a protective effect of each growth factor was seen in EPDCs as well as in HUVECs against serum starvation–induced cell death. This effect was 2-fold higher in EPDCs, whatever the growth factor used (Figure 5C).
doi.org/10.1182/blood-2003-08-2770

HUVECs were starved in endothelial cell basal medium (EBM)-2 (Cambrex) supplemented with 0.4% FBS for 24 h. HUVECs of passages 2–9 were used in the experiments.
doi.org/10.1186/s40360-017-0169-y

HUVEC were seeded in 12-well plates in regular medium and after 24 h growth factors and serum-starved overnight followed by treatment with VEGF and/or acacetin.
doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-13-0209
この条件で10%ぐらいは死んでいる。

はっきり明記してないものもあるが、どういう系があなたの実験にベストなのかということもあるので論文を調べ上げるべきではないかと申し上げた次第です。血清を完全になくすのではなく若干の加えるというのも多いです。もしあなたがなにか論文を参考にしていて、はっきりとわからないところがあるなら著者に問い合わせてみるのが筋だと思います。色々バリエーションがあるなら、他に興味がある他の実験のアドバイスがどこまで役に立つかということです。以下のようなことはちょっとしたコツみたいなものではありません。はっきりさせておくべきことです。そこは著者に責任がある部分でもあるので聞くべきことでしょう。

質問:スタベーションの条件はどれが適当でしょうか。
 @FBSを含む増殖因子全て(-)のHumedia-EB2でスタベーション。
 AFBSのみ入れたHumedia-EB2でスタベーション
 BFBS以外の増殖因子を入れたHumedia-EB2でスタベーション

(無題) 削除/引用
No.12080-6 - 2024/01/31 (水) 03:58:40 - LPS
この手の論文は数多く出てるので、著者に直接問い合わせればいいです。
実験が再現できなくて困っていると書けば、かなりの率で返事がきます。

Ox-LDLによる刺激ですが、2%牛胎児血清中に高濃度で入っているとも思えないので普通は飢餓に置く必要はないと思います。ただし、例えば使用する薬剤が2%の血清の影響を受けて不活化されてしまうなどがあれば別です。自分は基本的に、刺激による反応が見られるならば飢餓条件での実験は好みません。

ついでながら、 LONZAのEGM-2での血清飢餓の状態(成長因子は抜かない)では、24時間は大丈夫です。血清抜きのメディウムで2回洗浄しているので、残存血清の影響(もともと2%ですが)は無視できると。

スタベーションと言っても、実際にはserum starvation, glucose starvation等々あるので、注意。

(無題) 削除/引用
No.12080-5 - 2024/01/31 (水) 02:39:06 - HUVEC
書き忘れた。

FBSとgrowth factor全抜きで、BSAを0.1だったか1%にしてそれをスタベーション条件としてる論文がある、とはるか昔(20年近く前)に聞いたことがあります。でもその後話に出てこないから、あまり信頼のおける方法では無いのかも。

スタベーションメディアに変える際、それまでのメディアの吸引に2mlピペットを(イエローチップなどを先につけずに)そのまま使うと、culture mediaが結構な量(300-500ulとか)残ることがあります。これで更にPBSでの洗いを省略したりすると、この残ったメディウムのお陰で「20-30倍程度希釈したカルチャーメディア」とも言える状態になり、これのお陰で細胞が生き残ることがあります(経験有り)。HUVECを24-48時間と長時間スタベーションしても死なないと言ってる方は、もしかしたらこういうやり方をしてるのかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.12080-4 - 2024/01/31 (水) 02:20:25 - HUVEC
補足の補足。

実際にHUVECを使った実験をやってる人で無いと、

>先行論文では、「スタベーションを48時間行った」など簡単な文章がほとんど

これが本当のことで、ビックリするほど詳細が書いてない論文だらけだなんて想像がつかないと思います。おおさんが「論文をあたれ」というのは確かに当然のレスではあるのですが、本当に書いてない論文だらけなんですよ。

以下、スタベーションの条件は(1)FBSと全てのgrowth factor抜きでの話になります。

学会で「24時間スタベーションの条件だとHUVECはかなり死ぬのでは?」という質問をしたところ、いや死にませんよで終了したことがあります。でも、実際きちんとスタベーションの条件においたら死にますよね?(少なくとも、細胞がshrinkしてまともな形態を保ってない)トピ主に同意します。もしかしたら、死んだ細胞が多数でもお構いなしでそのまま実験を続けている可能性もあるかと思います。

スタベーション24時間の論文の著者が留学して来たので、24時間だと細胞かなり死んでない?と聞いたところ、実はスタベーションは行ってない、という返事でした。なんだそりゃ?

で、以前は私はスタベーションを1時間という短時間で行っていました(その後の刺激が30分。AKTのリン酸化を見てました)。が、スタベーション有り無しで実験をしてみたところ大した違いが見られなかったので、その後はスタベーション無しで実験をしています。勿論論文にもスタベーションの記述は無しです。念のために書くと、最後のメディウムチェンジ(これ自体がgrowth factorによる刺激になる)から24時間以上待って実験しています。

トピ主さんの実験条件でスタベーションが必須かどうかを確認してみるのも手だと思います。

質問者です 削除/引用
No.12080-3 - 2024/01/30 (火) 18:25:32 - はな
補足させていただきますが、論文等は調べたうえで質問させていただいております。

先行論文では、「スタベーションを48時間行った」など簡単な文章がほとんどです。ただ、どう考えても48時間も0%FBSの環境下で48時間もHUVECが生きているのは難しく(これは実証済みでほとんど死滅しました)、おそらく皆さん低血清でされてるのだと思います。ただ、その条件が書かれていないためにここで質問いたしました。

論文を調べろというのは簡単ですが、そうであるならばこのフォーラムは必要なくなります。論文に書いていないテクニカルなことを皆様からご教授いただければと思います。

(無題) 削除/引用
No.12080-2 - 2024/01/16 (火) 08:25:10 - おお
論文探しなさい。

少なくともICAM VCAMなどを検出したデーターが元になったデザインと言えるので、その文献すら見てないのは不思議。

HUVECのスタベーション条件について 削除/引用
No.12080-1 - 2024/01/15 (月) 21:20:11 - はな
HUVECにox-LDLでの刺激と薬剤添加を行ったのち、RNA抽出、PCR(ICAM-1、VCAM-1など)を行う計画を立てています。現在の培養条件および質問は以下の通りです。vitro実験を最近始めたので、知識不足ですみませんが分かる方やHUVEC培養されてる方などいらっしゃいましたら、どうぞよろしくお願いします。

 培地:HuMedia-EG2(基礎培地Humedia-EB2+増殖因子キット)
    
    増殖因子キット
      ・FBS(最終濃度2%)
      ・hEGF
      ・ハイドロコーチゾン
      ・hFGF-B
      ・ヘパリン
      ・ゲンタイマイシン・アンフォテリシンB
 
 質問:スタベーションの条件はどれが適当でしょうか。
 @FBSを含む増殖因子全て(-)のHumedia-EB2でスタベーション。
 AFBSのみ入れたHumedia-EB2でスタベーション
 BFBS以外の増殖因子を入れたHumedia-EB2でスタベーション

 質問:スタベーションの時間はどれが適当でしょうか。
    ちなみに、薬剤およびoxLDLは24時間刺激する予定です。
    FBS0%だと24時間も細胞が耐えられず、困っています。

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