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細胞を剥がすのはなぜ？ 削除/引用 No.12090-5 - 2024/01/19 (金) 19:55:49 - KYR 翌日、細胞骨格の観察をするということですが、細胞を剥がすのはなぜですか。もし通常の蛍光顕微鏡観察などをよていしているならば、それは方法としてちょっと違う気がします。 1 市販のチャンバースライド(googleで検索）に細胞を播種して1~数日間培養、 2 培地を除去してできるだけ静かにPBSで2回程度洗う（細胞によっては剥がれやすいので注意） 3 4%PFA-PBS（室温5分くらい, 10分以上は避ける）または冷メタノール（ー２０度５分くらい）で固定。 4 固定液を除きPBSで3回程度洗う 5 もしすぐに次に進まないならばPBSを加えて４度に保存。（保存は1, 2日以内にしたほうがいいと思う） 以下免疫染色等へ進む。

(無題) 削除/引用 No.12090-4 - 2024/01/19 (金) 06:53:21 - あの そもそも細胞の固定は、オーバーナイトだと長すぎて、1分から数分で良いのですが、勘違いしていないですか？　組織とは違います。 細胞も、通常は、4％パラホルムアルデヒド　入りPBSです。 細胞表面だけの染色に限定したいならCellcoverを使いますが。

(無題) 削除/引用 No.12090-3 - 2024/01/19 (金) 02:28:27 - おお やったことが無いので確証があるわけでは無いですけど、まず細胞を嗅が剥がす時に物理的に相当やられると思う。 RIPAは相当強い可溶化剤なので固定後に細胞を顕微鏡で観察するような実験ではまず使われない。 CHIPアッセイではPFAで固定した後RIPAで可溶化して目的のタンパクをIPし、結合するDNAを回収するわけだから、(処理の程度の違いがあるあるかも知れないが)細胞内の構造が維持できているとはおもえない。 勿論非常に安定な構造はそれでも見れて、そう言うものに関しては、そのプロトコールが確立していれば話は別。 顕微鏡で観察するなら、わざわざ剥がさないで、通常の免疫染色で使うような条件(バッファー)で実験を進めるべきかと思う。

(無題) 削除/引用 No.12090-2 - 2024/01/18 (木) 16:26:50 - AA RIPAバッファーの目的を考えてもらえれば細胞がどうなりうるか予想が付きそうです。 "RIPA"は"Radio-Immunoprecipitation Assay"いわゆる免疫沈降で用いるバッファーです。 免疫沈降法はタンパク質の相互作用を見る実験で、すなわち細胞からタンパク質を可溶化する組成になっていて、例えばTritonX100、デオキシコール酸ナトリウム、SDSなど、強力な界面活性剤を含有します。 端的に言えばLysisバッファーの一種ですので"細胞を溶かすためのバッファー"と言いかえることもできると思います。 そういったバッファーに、PFA固定されているとはいえ培養細胞を一晩つけておけばどういう事になりうるかは調べてみてください

RIPA Bufferについて 削除/引用 No.12090-1 - 2024/01/18 (木) 15:18:04 - ぽな 細胞培養をしている大学生です RIPA BufferでPFA固定をした接着細胞を剥がし、 その液をチューブに移し、一晩冷蔵で置いておくつもりなのですが、 細胞小器官が破壊されることなどはないでしょうか。 次の日、細胞骨格を観察しようとしています。 有識者の方、ご回答をお願いいたします。

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