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(無題) 削除/引用 No.12096-15 - 2024/01/25 (木) 08:31:38 - ねずみ 特殊な事情があって一組のプライマーでアレル特異的にPCRをかけたくて、一方のアレルは両プライマー完全一致、もう一方のアレルは片方のプライマーは完全一致でもう片方のプライマーは3'側5塩基のみ一致、という条件でPCRを試したことがあるのですが、5塩基一致でもバッチリ増えてしまい断念した経験があります（完全一致よりはわずかに増えが悪いですが）。 私の場合は特殊なケースかも知れませんが、10塩基一致していたらそれなりに増えそうな気がします。こればっかりは試してみないことにはなんとも言えないのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12096-14 - 2024/01/24 (水) 16:53:29 - イスパハン プライマーに記載のTmなんて概念的な物で、その温度で50%がアニールしてるなんて言えたものじゃない。 Tmは塩濃度の関数だけど、PCRのカクテルの塩濃度は使ってるポリメラーゼによってバラバラなんだからTmが何度かなんて分からん。 つまり、やってみるしかない。

(無題) 削除/引用 No.12096-13 - 2024/01/24 (水) 15:47:39 - おお あ、スプライシングバリアンとと言うことだし、RTの時にスペシフィックプライマーを使い仕込んでおけばいいかもね。

(無題) 削除/引用 No.12096-12 - 2024/01/24 (水) 10:51:50 - おお あ、わかった。3'側が共通の部分まで伸びているってことですかね。で後ろにはずらせない、、、のかな、、、 掛かりそうな気もするね。プライマーは１８ベースぐらいまで短くできないことはないですが、どうでしょうか。いま２３ベースなら５ベース共通部分が減らせるので改善はすると思う。 あるいは共通部分がないプライマー（多分十数マーでしょうけど）を作ってその５’側にタグをつけておいて２回目の増幅からはそのタグの部分もアニールするので通常のPCRになる。

(無題) 削除/引用 No.12096-11 - 2024/01/24 (水) 10:39:51 - おお 未だにストラテジーをわかりかねているのですが、片方のプライマーがA特異的なら２本鎖として増えるのはAだけだし。もう一方のプライマーをわざわざ１０ベースの共通のところだけを使っているのもよくわかりません。別に共通のところだけでなく前後A特異的な配列があるなら（特にプライマーの３’側）その配列を加えて標準の長さにしたらいいと思うし。 そのへん説明願えますか。

(無題) 削除/引用 No.12096-10 - 2024/01/24 (水) 09:16:36 - ぽー 簡単に思いついたのが、以下の３点です。 参考になれば。 ・電気泳動で分けることが許容されるのであれば、AもBも増幅される条件で増幅させて長さで確認する。長さの差を作りにくいのであれば片方のバリアントに特異的に存在する制限酵素で切断し、バンドの長さの差を出す。（両方のバリアント内に存在する制限酵素でも、ふたつのバリアントが長さの差で区別がつけられるのならOK） ・real time PCRにこだわるのであれば、Taqmanプローブを設計し、片方のバリアントのみを得意的に検出する。 ・タッチダウンサイクルのようにアニーリング温度を高い状態から徐々に下げていく

(無題) 削除/引用 No.12096-9 - 2024/01/23 (火) 12:45:53 - あの qPCRでの話ですか？ エンドポイントなら泳動条件で分けられるかもしれません。 温度下げると、プライマーダイマーが作られるかもしれないし、まずはやってみるしかないと思います。

(無題) 削除/引用 No.12096-8 - 2024/01/23 (火) 11:29:58 - G25 3'側の共通配列の部分をもっと短くする(2~3 ntとか）といいと思うのだけれど、差し障りありますか

(無題) 削除/引用 No.12096-7 - 2024/01/23 (火) 11:27:25 - G25 やってみなければわからない。 少なくとも、その実験デザインで100%うまくいく保証はありません。 まずはやってみればいいと思います。 Tmというのは相補鎖の50%がアニールする温度であって、その前後でアニールが0%か100%か、全か無かになるわけじゃない。3’ 末端10 ntのみの相補性で計算上Tmが30℃だからといって60℃で全くプライミングが起こらないとは限らない（私は多かれ少なかれ起こるだろうと思う）。 温度設定だけでなくプライマーの濃度なんかも関係するだろうし、ちょっとした手技の違いも影響するかもしれない（反応液調製中の温度管理とかhot startの厳密さとか）。

(無題) 削除/引用 No.12096-6 - 2024/01/23 (火) 11:26:04 - G25 >初めのサイクルでごく僅かにBが増えたとしても、プライマーのうちでBに相補的な配列は常に10bp（Tm値30℃）のままであり Aのプライマーで複製されたBは末端がAプライマーの配列になるから、100%マッチ

(無題) 削除/引用 No.12096-4 - 2024/01/23 (火) 11:02:28 - N55 1サイクル目で仮にBを鋳型にプライマーが伸長されたDNAがあったとすると、その新しいDNAは既にAを鋳型に伸長されたものと区別が付きません。 AとBが同じ量あれば当然Aのほうが効率よく増幅されますが、無視できるかどうかは条件によります。極端な話100サイクルやれば区別つかないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12096-3 - 2024/01/23 (火) 10:53:11 - ちょっと ありがとうございます。おっしゃるように、増幅効率を比較するのが一番ですが、仮に初めのサイクルでごく僅かにBが増えたとしても、プライマーのうちでBに相補的な配列は常に10bp（Tm値30℃）のままであり、かたやAは常にがんがんに増えていくので、Bのフラグメントはは A に対して（おそらく）無視できるほど少ないと考えられないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12096-2 - 2024/01/23 (火) 10:35:14 - N55 サイクル数などの条件によるのではないでしょうか。 初期のサイクルにごくわずかでもBを鋳型に反応してしまえば、その後のサイクルではAと変わりない効率で増幅されます。 AとBを鋳型にして、増幅効率を比較しないことには何とも言えません。

Tm 値、アニーリング温度 削除/引用 No.12096-1 - 2024/01/23 (火) 10:07:25 - ちょっと Tm 値30℃のプライマーを用いてアニーリング温度60℃でPCRを行ってもフラグメントはまず増えないと考えても大丈夫でしょうか。 スプライスバリアントA, BのAだけを検出したくて、プライマーの5' はバリアントAに対してのみ相補的な配列、3'側はABに共通の10bp配列となるように設計しています。この10bpだけだとTm値が30℃になるため、Bのフラグメントは増えないだろうという戦略です。

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