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(無題) 削除/引用 No.12101-18 - 2024/01/26 (金) 12:07:35 - おお まさかこれはないだろうと思いながら、、、 今使っている血清と相性が悪いとか、、、でも普通はそんな極端なことはないというか経験したことはないですが、、、

(無題) 削除/引用 No.12101-16 - 2024/01/25 (木) 10:16:48 - ああ 私もHepG2扱ってますが、一日もおけば生細胞はコートなしでも培養dishに接着・増殖しますし、低密度でも同様なので他チューブもダメとなればストック側の問題のような気がします。 原因としては、バイアル当たりの細胞数が多すぎる、急速冷却可な凍結保存液を使わずに急速冷却した、一時的に停電・フリーザーの故障等で温度が上昇してた、とかでしょうか… ストック何本か起こして、トリパンブルー染色で生存率みて80-90%なければ新しい細胞買ったほうがいいかと思います

(無題) 削除/引用 No.12101-15 - 2024/01/25 (木) 09:25:44 - おお 他の細胞が大丈夫そうなのでそれはないかと思いますがインキュベーターのCO2表示が長期使用でずれて来てほとんどCO2が供給されてないとかないかも必要なら確認してみてください。

(無題) 削除/引用 No.12101-14 - 2024/01/25 (木) 08:41:07 - ぽー ルーチンワークでHepG2培養しています。 起こすときはある程度以上の密度を維持しないと増殖をしないか細胞の状態が極端に悪くなります。 一度状態が悪くなった細胞でストックを作ると、その次に起こす時から状態が悪いままなので、ストック用の細胞のコンディションには気を使っています。 感覚としては 10cmに起こす→次の日に2枚に継代→2日後に4〜５枚に継代 くらいにできるようなストックの細胞数が必要だと感じています。 ただ、培養自体は難しい細胞ではないので、ストックの状態が気になるところです。 以前に作った細胞のストックがあれば、それを使ってみるのもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12101-13 - 2024/01/25 (木) 06:48:55 - あの それから思いつくのは次です: 高グルコースで培養してみる 培養液の作り直し ダメと思っても、そのまま培養し続けてみる 融解後の洗いの回数を増やす 最初は小さめの容器で培養 インキュベーター内の温度、ガス濃度、湿度は本当に大丈夫か

(無題) 削除/引用 No.12101-12 - 2024/01/25 (木) 03:41:16 - おお >[Re:5] 道民さんは書きました : > 同じボトルの培地を常時使っているのはその細胞のみです。 > > 一時的に別の細胞種において播種の際に使用している人はいましたがその際の細胞には問題は起きていません。 培地は大丈夫ということですね。たまにグルタミン不含の培地にグルタミン入れ忘れてたりという事があったりもしますので。 > マイコプラズマの場合細胞に特徴的な死に方などはあるんでしょうか。 異常な細胞増殖、フェノールレッドの色の変化が早い、死細胞の増加などです。しかし細胞や環境によっては増殖が遅くなったり、結構耐性があってレジスタントになっている場合もあります。場合によっては異様な培地の匂いがすることもあるようです。マイコプラズマは哺乳動物を観察するぐらいの顕微鏡では見れませんからそれで判断するのは難しいと思います。 >[Re:6] 道民さんは書きました : > > NEAAとpoly Lysのコートは使用していませんでした。 MEMやDMと血清だけで昔飼ってたことがあります。コートなどもしてませんでしたので、それで培養できるとは思います。肝機能を追求したりするにはもしかしたら実験によってはコラーゲンコートなどしたほうがいいのかもしれません。 もしやってなかったら凍結チューブ融解直後のViabilityを見てはどうかと思います。その時点でだめだったら何をやってもだめでしょうから。 それと、少数でも生き残って接着した細胞はいませんか？多少コンディションが悪くてもいくらかは接着して増えてくることはまあまああります（そういう細胞を使っていいかという話はありますが）。

(無題) 削除/引用 No.12101-11 - 2024/01/24 (水) 22:02:46 - tg 日本組織培養学会のHPみると組織培養質問箱フォーラムというのがあるとおもうので、そこにメールで投稿して聞いてみればどうでしょうか。その方面の専門家の先生方が回答してくれます。

(無題) 削除/引用 No.12101-10 - 2024/01/24 (水) 21:55:36 - あの 凍結課程や、超低温保持には問題ないのですか？ さほど再入手が難しくない細胞ですから、再入手の検討も。

(無題) 削除/引用 No.12101-9 - 2024/01/24 (水) 20:06:06 - 道民 ＞当方の記憶では、HepG2は、そんなに難しい細胞ではなかったので、48時間も置いたなら、通常は大丈夫なはずです。コーティングも特にしなかったです。 個人的に継代などおこなってて培養に苦戦したこともなかったので突然融解が上手くいかなくなることに戸惑っています。 コーティングも過去行ったことはありません。 当研究室で過去に同じような事例があったとは聞いたのですが解決法や原因までは伝わっていませんでした... 指導教授に聞いてもわからないの一点張りです。

(無題) 削除/引用 No.12101-8 - 2024/01/24 (水) 19:48:30 - あの 当方の記憶では、HepG2は、そんなに難しい細胞ではなかったので、48時間も置いたなら、通常は大丈夫なはずです。コーティングも特にしなかったです。

(無題) 削除/引用 No.12101-7 - 2024/01/24 (水) 18:43:19 - 道民 ＞念のため培養開始24時間以上は、ほったらかした方が良いです。 顕微鏡観察しようとすると、ゆすられて、接着しかけた細胞が浮遊して活力が低下しうるので。 融解してから48時間は動かしていませんでした。48時間後に接着を確認したのですがそこから浮遊する場合もあり得るのでしょうか...

(無題) 削除/引用 No.12101-6 - 2024/01/24 (水) 18:41:34 - 道民 ＞以前は今と同じ培地の同じ条件でHepG2が増えてたのでしょうか？私がこの細胞を使ってたときはNEAAとpoly Lysのコートを使ってましたが、使われてます？ 以前も同様の培地で培養していました。しかし、増殖速度は遅い印象です。 年末年始の閉室に伴ってすべて凍結させて、年始に融解を始めてから今までずっとうまくいってない状態です。 NEAAとpoly Lysのコートは使用していませんでした。

(無題) 削除/引用 No.12101-5 - 2024/01/24 (水) 18:37:05 - 道民 同じボトルの培地を常時使っているのはその細胞のみです。 一時的に別の細胞種において播種の際に使用している人はいましたがその際の細胞には問題は起きていません。 マイコプラズマだった場合他の細胞種にも影響が出ると思うのでコンタミではなさそうと感じているのですが... マイコプラズマの場合細胞に特徴的な死に方などはあるんでしょうか。 現状顕微鏡の視野で見る限り異物のようなものは見当たりません。

(無題) 削除/引用 No.12101-4 - 2024/01/24 (水) 17:39:03 - あの 念のため培養開始24時間以上は、ほったらかした方が良いです。 顕微鏡観察しようとすると、ゆすられて、接着しかけた細胞が浮遊して活力が低下しうるので。

(無題) 削除/引用 No.12101-3 - 2024/01/24 (水) 16:26:34 - toto 以前は今と同じ培地の同じ条件でHepG2が増えてたのでしょうか？私がこの細胞を使ってたときはNEAAとpoly Lysのコートを使ってましたが、使われてます？

(無題) 削除/引用 No.12101-2 - 2024/01/24 (水) 15:51:49 - おお その同じボトルの培地で他の細胞は増えてますか？ マイコプラズマかなぁと言う気もしますが。 ２日経たないと接着してないので有れば、それも変だね。

HepG2細胞の融解 削除/引用 No.12101-1 - 2024/01/24 (水) 15:32:09 - 道民 現在HepG2細胞を主に実験で使用しているものです。 最近連続してHepG2細胞の融解が上手くいきません。 具体的には融解から２日後にdishへの接着が確認されましたが翌日にdish内に異常に細胞が増殖しその全てが浮遊している状態でした。 凍結時の細胞状態が悪かったと推測し他のチューブを融解しても同様の症状ですべて死んでしまいます。 コンタミや手技ミスも疑いましたが自身が培養している他の細胞株には何の症状も現れていません。 この場合どのような原因が考えられますでしょうか。 ちなみに現在のHepG2の培養条件は10%FBSのDMEM低グルコース培地で行っています。

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