全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12108-10 - 2024/02/02 (金) 02:13:23 - dsRNA hypotonicバッファで細胞質のRNPを集めるのは簡単にできる、いい方法だと思います。ありがとうございます。 実は今日、dsRNAシグナルが見えて、S／N比が悪かったのですが、dsRNAを濃縮すると解決するのかもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.12108-9 - 2024/02/01 (木) 02:42:33 - おお >[Re:8] dsRNAさんは書きました : > lysisバッファーに対する細胞数を増やして濃縮する場合には、ゲノムDNAの粘性がネックになるので、あまりたくさんの細胞を溶かすことはできなさそうですね。 クルードなのでやりにくいとは思います。粘性はポアサイズのでかい（ある意味ガバガバの）マイクロチューブにはめれるフィルターみたいなものを通せば解消できる（昔のGEのRNA抽出キットはそういうのが付属でついてきた）。 RNAase inhibitorsをいれた低張溶液で細胞を破裂させてCytosolだけを取るという手段はあり得ると思いますが、RNAase inhibitorsがどれほどRNAを維持してくれるか不安な部分はありますけど。 またドット状に染まるということなので、ある程度パックされたような状態でRNAがいるなら、上記Lysateを超遠心にかけ濃縮する事もあり得ると思います。 > > すると、精製したRNAからdsRNA抗体でIPして濃縮すればよさそうに思いますが、精製RNAのドットブロットが以前にうまく行かなかったので、躊躇しています。 精製すればRNAだけニトロセルロース膜にスポットできるわけだからIPまでしなくても感度は上がるはずだと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.12108-8 - 2024/02/01 (木) 02:01:00 - dsRNA lysisバッファーに対する細胞数を増やして濃縮する場合には、ゲノムDNAの粘性がネックになるので、あまりたくさんの細胞を溶かすことはできなさそうですね。 すると、精製したRNAからdsRNA抗体でIPして濃縮すればよさそうに思いますが、精製RNAのドットブロットが以前にうまく行かなかったので、躊躇しています。

(無題) 削除/引用 No.12108-7 - 2024/01/31 (水) 03:16:01 - おお >[Re:6] dsRNAさんは書きました : > HSV-1感染細胞でどの程度dsRNAについて、IFでは、ポジコンのウイルスに感染した細胞に比べてかなりシグナルが弱いということしか言えません。 > ただ、ドットブロットで検出したポジコンサンプルのシグナルはかなり強く、仮にシグナルがその1/10に減ったとしても、十分検出できるはずなのです。 > ですので、量的というよりは質的な問題が潜んでいる気がします。 濃縮することは考えてないですか？

(無題) 削除/引用 No.12108-6 - 2024/01/30 (火) 21:00:16 - dsRNA HSV-1感染細胞でどの程度dsRNAについて、IFでは、ポジコンのウイルスに感染した細胞に比べてかなりシグナルが弱いということしか言えません。 ただ、ドットブロットで検出したポジコンサンプルのシグナルはかなり強く、仮にシグナルがその1/10に減ったとしても、十分検出できるはずなのです。 ですので、量的というよりは質的な問題が潜んでいる気がします。

(無題) 削除/引用 No.12108-5 - 2024/01/30 (火) 05:37:30 - おお そのへんは断定できることは存じ上げていません。 たとえばRNAにdsRNAの部分に加え一部ssRNAが露出していた場合露出が多いほどNC膜の吸着に有利です。なのでポジティブチャージのナイロンメンブレンを勧めたわけです。これならdsRNAでもある程度吸着が改善されます。 それぞれ細胞内でどの程度dsRNAが産生されるかという点では数字を持ってますか？

(無題) 削除/引用 No.12108-4 - 2024/01/30 (火) 01:08:09 - dsRNA ＞おお様 アドバイスをありがとうございます。HSV-1以外のウイルスではdsRNAが検出できたことから、HSV-1特異的に検出されない理由があると思われますが、これについて何か案はお持ちでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12108-3 - 2024/01/27 (土) 04:25:03 - おお >[Re:2] おおさんは書きました : > SDSは強力な変性剤ですからタンパクの存在はあまり気にならないけど、尿素とか加えてみるか あ、尿素は一本鎖への変性効果が条件によっては出るかもしれない、、、ならSDS抜きでグアニジンか、、、 ほんというとSDSもちょっと嫌なんですよね、、、蛋白とかNCに吸着するのを阻害するし、、、メタノールをいくらか加えると改善するかなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.12108-2 - 2024/01/27 (土) 01:44:29 - おお サイズによるけどニトロセルロースへの吸着が弱い可能性はないでしょうか？サザンブロットでも変性して一本鎖にしないと吸着しにくいそうですし。ポジティブチャージのナイロンを私は、2本さのDNAを吸着させるのに使ってます。 SDSは強力な変性剤ですからタンパクの存在はあまり気にならないけど、尿素とか加えてみるか、proteinaseK処理してみる？

herpes simplex virus 1 (HSV-1)感染細胞のdsRNAの検出 削除/引用 No.12108-1 - 2024/01/27 (土) 00:59:57 - dsRNA 通常HSV-1ウイルスに感染したヒト細胞においては、ウイルス由来のendoribonuclease VHSによってdsRNAの産生が抑えられているのですが、VHSを欠いたHSV-1感染細胞ではdsRNAが蓄積することが知られています。 このdsRNAを定量するため、1% SDSをふくむ高張バッファーで感染細胞を可溶化し、Lysatesをニトロセルロース膜にスポットし、dsRNAに対する抗体反応でシグナルを検出しようとしています。 ポジコンである、別のウイルスの感染細胞から調整したLysatesではシグナルが検出できたのですが、VHSを欠いたHSV-1感染細胞ではシグナルが検出できませんでした（未感染細胞と同程度）。IFではシグナルが見えるので、dsRNAは産生されているはずです。 dsRNAシグナルを検出するためには、どのような工夫が必要でしょうか？ 可能性として考えているのは、１）ウイルス由来のdsRNA結合蛋白質がdsRNAをマスクしている、２）dsRNAは細胞質で顆粒状のRNP構造をとるため可溶化できていない、ですが、1％ SDSでdsRNAを丸裸にできないものなのか、疑問に思っています。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---