BioTechnicalフォーラム [共焦点レーザー顕微鏡データからの蛍光強度定量について]

共焦点レーザー顕微鏡データからの蛍光強度定量について

No.12110-TOPIC - 2024/01/27 (土) 15:15:21 - 化学屋

ラボで細胞関係の実験・解析に詳しい人がいなく、いろいろと調べてみても分からなかったためここで質問させてください。

細胞を蛍光染色試薬を用いて共焦点でライブセルイメージングをし、得られた画像データから蛍光強度を定量したいのですがどのように処理すれば良いのかいまいちはっきりしなく、困っております。
(共焦点データでの定量はほぼ意味が無いことは承知しておりますが、ラボの事情によりせざるを得ない状況にあります。)

Fijiを用いて一定の強度を閾値として平均強度をとる方法や、CTCFを求める方法など試してみましたが、エラーバー(標準偏差)が非常に大きく、データ間で比べようにも比べられない状況です。

考えてみると、フォーカスしたz軸以外からの蛍光もある程度検出されるため、エラーが大きくなるのは当然な気もしますが。。。

しかし、共焦点の画像データから強度をプロットしたFigを載せている論文はそこそこ有りますが、どれもエラーが小さく、もしかしたら自分の解析方法が良くないのかと思いました。

そこで、共焦点の画像データから強度を定量するような解析する場合、どういった処理をすれば良いのか教えていただけないでしょうか。
　

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No.12110-9 - 2024/01/29 (月) 11:47:42 - あ

全ての細胞で焦点面が合わなかったり、細胞の状態は違うので、細胞ごとオルガネラごとに蛍光強度はバラつくのは普通です。スレ主さんが引用している論文でも、写真の蛍光のばらつきとグラフのエラーバーの長さが一致していないですよね。

ライブイメージングとのことですので、どうしてもエラーバーを小さくしたければ、同じ細胞をタイムラプスで処理前処理後の継時変化の相対値(%)でグラフにしたらどうですか。

あるいは正直に大きなエラーバーでグラフにしても良いと思います。変にエラーバーを小さくするような処理は不自然になりますよ。

>行いたいことは以下の Fig b のような解析をしたいと思っております。

>https://www.researchgate.net/figure/Relative-fluorescence-intensity-b-and-the-corresponding-CLSM-images-a-of-CNE-2-cells_fig3_331721959

(無題)

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No.12110-8 - 2024/01/29 (月) 07:47:21 - おお

>[Re:6] 化学屋さんは書きま

>
> 以下共焦点撮影の操作
> サチュレートピクセルを作らないような設定にし、x枚のディッシュについて同じ設定で撮影を行う。
>
すべてのdish の中で一番強いintensity を基準にしてその条件で撮影したと言うことですね。

オルガネラなど
強弱が見られるとの指摘ですが、さいぼうを染めたりすると均一に染まる事って珍しく思います。いっその事z軸スキャンしてzスタックのイメージから解析したらどうでしょうか。

(無題)

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No.12110-7 - 2024/01/28 (日) 20:39:09 - 化学屋

>[Re:5] おおさんは書きました :
> 撮影条件、画像出力の条件、染色条件など揃っていないと比べられべられないと思いますが、その辺りはどうでしょう。

撮影条件、画像出力の条件、染色条件などは比較したいディッシュ間において揃えております。

>[Re:4] おおさんは書きました :
> >[Re:1] 化学屋さんは書きました :
> >
> > 考えてみると、フォーカスしたz軸以外からの蛍光もある程度検出されるため、エラーが大きくなるのは当然な気もしますが。。。
> >
>
> 共焦点ですよね、、、
>

共焦点です。。
細胞のオルガネラを染色した際に得られた画像を見ると細胞内でも蛍光強度に強弱が見受けられます。
この原因は共焦点でもある程度のZ幅の情報を記録していると考えられるため(ピンホールサイズにもよると思いますが。。。)、強度に強弱がついているのかと思っておりました。

なおピンホールは1.2AUとしております。

(無題)

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No.12110-6 - 2024/01/28 (日) 20:26:51 - 化学屋

状況が抽象的でした。申し訳有りません。

行いたいことは以下の Fig b のような解析をしたいと思っております。

https://www.researchgate.net/figure/Relative-fluorescence-intensity-b-and-the-corresponding-CLSM-images-a-of-CNE-2-cells_fig3_331721959

具体的な蛍光染色試薬ですが、自分で合成した化合物がメインですがHoechst、MitoTracker、LipiDyeなど実験によっては使用します。

抗体を用いた染色は行っておりません。

具体的な操作は以下の通りです。

・Hela細胞をガラスボトムディッシュに播種、一晩インキュベート
・培地を除去し、PBSで洗浄
・染色試薬を含む培地を加え、30分インキュベート
・培地を除去、PBSで洗浄しFluoroBrite(フェノールレッドフリー培地)を加え共焦点撮影
上記の操作をx枚のディッシュで行う。

以下共焦点撮影の操作
サチュレートピクセルを作らないような設定にし、x枚のディッシュについて同じ設定で撮影を行う。

得られた画像から各ディッシュごとについて、縦軸:蛍光強度、横軸:各ディッシュのデータを作成したいと思っておりました。

その際のデータ処理について皆様方はどのような処理をしているのかお聞きしたく思っております。

どうぞよろしくお願いいたします。

(無題)

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No.12110-5 - 2024/01/28 (日) 20:21:36 - おお

撮影条件、画像出力の条件、染色条件など揃っていないと比べられべられないと思いますが、その辺りはどうでしょう。

(無題)

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No.12110-4 - 2024/01/28 (日) 20:18:28 - おお

>[Re:1] 化学屋さんは書きました :
>
> 考えてみると、フォーカスしたz軸以外からの蛍光もある程度検出されるため、エラーが大きくなるのは当然な気もしますが。。。
>

共焦点ですよね、、、

(無題)

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No.12110-3 - 2024/01/28 (日) 07:53:41 - SN

蛍光染色試薬で何を測定しているのか開示することは可能ですか？
具体的なほうが経験者の方からアドバイスがもらいやすいかと

(無題)

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No.12110-2 - 2024/01/28 (日) 03:03:16 - あの

数値化以前、数値化、数値化後の要因が複雑に絡んでいて、詳細を知らない他人がお答えしにくく感じます。

数値化の段階に限って言えば、お使いの共焦点顕微鏡のソフトウェアの中だけでも、結構色々なことができるのではないかと想像します。まずは、そのメーカーのユーザーサポートに画像を見せながら相談してみたらいかがでしょうか。

そのステップの後には、数値化以前や以後の対策が見えてくると思います。

なお数値化以後の話ですが、生データの散布図を書いてみて、仮説を立てて、データの分布に見合った適切な手法を選ぶとかといった話になります。たとえば、対数分布なら、対数変換するとか。二群の比較ならt検定とか。

共焦点レーザー顕微鏡データからの蛍光強度定量について

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No.12110-1 - 2024/01/27 (土) 15:15:21 - 化学屋

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