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(無題) 削除/引用 No.12119-13 - 2024/02/06 (火) 01:26:37 - おお 動物細胞で、余分な配列が有るけど構わずプラスミドを導入する場合を書いておきます。 レトロウイルスやレンチウイルスにパッケージングするための発現ベクターをパッケージングせずに導入する場合です。 パッケージング用シグナルやLTRなどを含んでますが、直接導入した場合不要です。レンチの場合余分な配列のためにからベクターでも8kbp以上になってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.12119-12 - 2024/02/05 (月) 13:26:09 - Tany >egeria様 はい、ご指摘の通りです。 今所有のものをそのまま流用できればと思った次第です。 皆さんから頂いたコメントを総合すると、必要な領域のみをクローニングベクターに移すのが最適な方法のように思います。 実験の進め方について方向性が見えてきました！ ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.12119-11 - 2024/02/02 (金) 20:42:27 - egeria もしかしてですが、アグロバクテリウム用のバイナリーベクターを使っていませんか？　OriVとtrfAが存在するなら、それは広域宿主ベクター（RK2）をバックボーンにしていると思います。大腸菌とアグロの両方で複製させるためにそういう複製起点が必要になります。 そういう領域はアグロを使った形質転換に必須なので、洗練されていないから残っているのではなく、必要だから残っているのです。もっとも、RK2ベースのバイナリーベクターはかなり古いタイプですが。。。 プロトプラストの形質転換をアグロでやる場合もありますが、PEG-CaCl2でやっているなら、それらの領域は必要ありませんから、適当なクローニングベクターに移してよいと思います。たぶん、アグロ用のプラスミドとして作られたものを流用しているんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12119-10 - 2024/02/02 (金) 16:50:19 - Tany 皆様， 様々なご意見ありがとうございます！ プラスアルファの情報も頂き大変ありがたいです。 PCRで行う方法はあまりメジャーなやり方ではないようですね。 私自身今回が初めてのトライになるので、せっかくなら両方のやり方で試してみようかと思います。 植物形質転換用のベクターはサイズがでかい＋コピー数もあまり多くないので、いったん必要な領域を使いやすいクローニングベクターに入れてみます。 ありがとうございました！ >しかし質問されている方の余分な配列ってなんなんでしょうかねぇ。。。 OriやらtrfAが含まれています。植物用バイナリーベクターって大昔にベースとなるものが開発されてからあまり洗練されてきていないイメージなんですよねぇ．．．

(無題) 削除/引用 No.12119-9 - 2024/02/01 (木) 12:39:29 - 774R いずれにせよ、目的の遺伝子がちゃんとintegrationされてることをクローン取得後に行う必要があるから大差はないのかなという気もする。 プロモーター-目的遺伝子-IRES-耐性遺伝子 というベクターを使えば全長が機能する形で入ってるクローンの確立が上がりますね。 最近は、integraseをco-transfectionして認識配列に挟まれた部分がそっくりゲノムに挿入する手法ばかり使ってるので、ほぼ当たりクローンしか取れない。

(無題) 削除/引用 No.12119-8 - 2024/02/01 (木) 09:12:40 - プラス 例えば、インサート6 kb、ベクター2 kbのプラスミドを使ってstable lineを取りたいとき サークルのままで導入したくはないかな。transientならサークルでやるけど。

(無題) 削除/引用 No.12119-7 - 2024/02/01 (木) 03:06:01 - おお 直鎖状DNAのほうがIntegrationの頻度が上がるという話はありますね（安定株を作る場合）。場合によってはIntegrationされるコピー数のコントロールがし易いとか、Homologous recombinationが起きやすいとかいう話があったような気がする。 ＞環状だとプラスミドのどこで切れてゲノムに挿入するかわからないので、直鎖上にしてフラグメントの端の方で入ってもらうため なんか具体的に実験で分析しているものがありますかね、、、直鎖上にしても薬剤耐性マーカーの部分だけゲノムに挿入されたりとかありそうなので。 イーストなんかも特に直鎖にするケースはあまりなさそう（自立して複製されるプラスミドも多いけど）。 しかし質問されている方の余分な配列ってなんなんでしょうかねぇ。。。 発現したいcDNAをテンプレートにプロモーターやポリAシグナルをタグとしてつけてPCRで増幅してそのままトランスフェクションというのは見たことがありますが、あまり流行らなかった？ような気がする。PCR自身エラーがある意味起こりやすい手法なのでちょっと気持ち悪いという話もなくはない。 余分な配列を除くには必要な配列、大腸菌のOriと大腸菌の薬剤耐性マーカーが残る形でPCRして大腸菌に形質転換すればシンプルなプラスミドができなくもない。

(無題) 削除/引用 No.12119-6 - 2024/01/31 (水) 21:13:27 - SV40 直鎖にしたらしたでエキソヌクレアーゼで削られて不完全にないそう

(無題) 削除/引用 No.12119-5 - 2024/01/31 (水) 17:14:46 - pose 自分は動物細胞でトランスポゾンを使っています。 精製したプラスミドをそのままトランスフェクションするだけでバックボーン以外のターゲット配列をゲノムに転移でき、直鎖状にする必要がありません。 植物でもイネでpiggyBacで遺伝子改変している例があるようですね。

(無題) 削除/引用 No.12119-4 - 2024/01/31 (水) 13:27:51 - あ 動物細胞で私はいつも直鎖にしてますよ（してましたよ）。今は安定発現細胞作製にはレンチ・レトロウイルスを使うのでDNAを直接トランスフェクションすることはほとんどなくなりましたけれど。 環状だとプラスミドのどこで切れてゲノムに挿入するかわからないので、直鎖上にしてフラグメントの端の方で入ってもらうため、と私は教わりました。 プラスミドをシングルカットの制限酵素で切って、キアゲン精製してトランスフェクションしてます。PCRで増やすのでもいいのでしょうけど、マキシプレップをシングルカットしてます。大腸菌用の余計な配列も入りますけど気にしません。

(無題) 削除/引用 No.12119-3 - 2024/01/30 (火) 18:22:03 - Tany >>おおさん ご回答いただき有難うございます。 私の使用するサンプルのプロトコルでは直鎖状DNAを使用することになっていたのでこれが一般的な事なのかと勘違いしていました。サンプルによりけりなのかもしれません。 植物用ベクターはサイズの大きいものが多くて、私が今使用しようとしているものはoriを含む不要な領域が10 kbpくらいあるんですよねぇ．．．必要な部分を一旦サイズの小さいクローニングベクターに入れ直すというのも手かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12119-2 - 2024/01/30 (火) 17:53:25 - おお 哺乳類、特に人やマウスでは、何か事情がないなら、環状のままで導入することが大抵です。余分な配列は大腸菌で使う薬剤耐性やori でしょうけど、別に邪魔する訳でもない(しんかくせいぶつで何の意味も持たない)ので大抵は気にしません。サイズ的にも2kbぐらい出ないですか？真核生物の薬剤耐性を含むようなベクターは6、7kb以上になることも多くそのうちの2kbが長いかどうかと言えば、、、どうでしょうか？

トランスフェクション用直鎖状DNAの調整について 削除/引用 No.12119-1 - 2024/01/30 (火) 16:49:38 - Tany ある植物細胞 (プロトプラスト) へ外来遺伝子をトランスフェクションし、安定形質転換体を作出する計画を立てています。 トランスフェクションには直鎖状DNAを用いる事が一般的だと思います。その場合、外来遺伝子を含むプラスミドを制限酵素処理して直鎖状にするやり方をよく見る気がするのですが、余分な配列を多く含んでしまう点やサイズが大きくなってしまう点に気持ち悪さを感じています。 別のやり方として、必要な領域をPCRで増幅してトランスフェクションに使用する方法もあると思います。この方法であれば必要な領域だけを選択して導入できますし、必要量も簡単に得られる気がしています。 皆様はどのように直鎖状DNAを調整していますでしょうか。 私は植物細胞を扱っていますが、動物細胞を扱っている方のご意見も是非お聞かせください。 よろしくお願いします。

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