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Real time PCR (比較Ct法) のデータ処理について トピック削除
No.1213-TOPIC - 2012/12/03 (月) 22:20:09 - German
最近、研究室にやっとReal time PCRを導入し、SYBRgreenを使った比較Ct法を用いて検討しています。

通常、一回の実験をtriplicateで、ハウスキーピング遺伝子およびターゲット遺伝子を検討しています。

例)
とある細胞株にて、Control群(未分化細胞群)および分化細胞群からRNAをそれぞれ単離し、逆転写でcDNAを作製しました。
そのcDNAを用いて、ハウスキーピング遺伝子およびターゲット遺伝子をtriplicateで、Real time PCRを行いました。
キャリブレーターサンプルはControl群にしています。

その場合、グラフは、triplicate内で誤差(SEM)をとり、n=3としてグラフにしています。

ここで、質問があります。
例えば、同様の実験を3回行ったとして、それらを合わせてグラフにする場合です。

例)
実験一回目 Control群1, differentiated群1
実験二回目 Control群2, differentiated群2
実験三回目 Control群3, differentiated群3
のcDNAがあり、それぞれ別のplateでReal timeを行っています。
またReal time PCR解析の際に、Control群(1回目のControl群の細胞(*)もしくはあらかじめ用意した未分化細胞のcDNA)をキャリブレーターにします。(*)一回目のControl群のcDNAを二回目、三回目の実験のplateにも用意するという事です。

質問@
その場合、3回通して、キャリブレーターに同一のものを使っているので、一回目、二回目、三回目の平均値をそれぞれもってきて、n=3としてグラフを作製できると思うのですが、これは正しいでしょうか?(n=3x3=9はさすがにないと思いますが)。

質問A
またその際、Control群の2^-ddCt値が1からちょっとずれてしまうと思うのですが、そのままグラフにしてもよろしいのでしょうか?もしくは、Control群を1に補正して(当然differentiated群をそれに合わせて補正)し、グラフにすべきでしょうか?

分かりにくかったらすいません。
Real time PCRのデータは、前者の例のような何回かやった内のチャンピオンデータを論文などに載せるべきか、後者のように最低3回やったデータを合わせたものを載せるべきか、と疑問に思いました。
 
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.1213-3 - 2012/12/05 (水) 21:36:15 - German
やはりチャンピオンデータだとそういう印象になりますよね。
ありがとうございました。

Re: 削除/引用
No.1213-2 - 2012/12/04 (火) 18:33:29 - UC
こんにちは。この手のは過去スレッドにいくつか挙がっているので、検索すると出てくると思います。後、webで「abi user bulletin #2」で検索して出てくるPDFは、比較Ct法をやるなら必読です(もうお読みになっているかもしれませんが)。
質問(1):良いんじゃないんでしょうか。書かれている通り、technical triplicateと独立試行は分けて考えるべきです。

質問(2):比較Ct法を採用している時点で、基準は相対的なものです。示したいものが2群の差であるのであれば、そのまま見せようが1にしようが構わないと思います。

読み手からすると、Real time PCRのデータで単一のチャンピオンデータを見せられてもたまたまじゃない?としか言えません。複数回の試行でSDあるいはSE付きで示されたら、色々判断できると思います。

Real time PCR (比較Ct法) のデータ処理について 削除/引用
No.1213-1 - 2012/12/03 (月) 22:20:09 - German
最近、研究室にやっとReal time PCRを導入し、SYBRgreenを使った比較Ct法を用いて検討しています。

通常、一回の実験をtriplicateで、ハウスキーピング遺伝子およびターゲット遺伝子を検討しています。

例)
とある細胞株にて、Control群(未分化細胞群)および分化細胞群からRNAをそれぞれ単離し、逆転写でcDNAを作製しました。
そのcDNAを用いて、ハウスキーピング遺伝子およびターゲット遺伝子をtriplicateで、Real time PCRを行いました。
キャリブレーターサンプルはControl群にしています。

その場合、グラフは、triplicate内で誤差(SEM)をとり、n=3としてグラフにしています。

ここで、質問があります。
例えば、同様の実験を3回行ったとして、それらを合わせてグラフにする場合です。

例)
実験一回目 Control群1, differentiated群1
実験二回目 Control群2, differentiated群2
実験三回目 Control群3, differentiated群3
のcDNAがあり、それぞれ別のplateでReal timeを行っています。
またReal time PCR解析の際に、Control群(1回目のControl群の細胞(*)もしくはあらかじめ用意した未分化細胞のcDNA)をキャリブレーターにします。(*)一回目のControl群のcDNAを二回目、三回目の実験のplateにも用意するという事です。

質問@
その場合、3回通して、キャリブレーターに同一のものを使っているので、一回目、二回目、三回目の平均値をそれぞれもってきて、n=3としてグラフを作製できると思うのですが、これは正しいでしょうか?(n=3x3=9はさすがにないと思いますが)。

質問A
またその際、Control群の2^-ddCt値が1からちょっとずれてしまうと思うのですが、そのままグラフにしてもよろしいのでしょうか?もしくは、Control群を1に補正して(当然differentiated群をそれに合わせて補正)し、グラフにすべきでしょうか?

分かりにくかったらすいません。
Real time PCRのデータは、前者の例のような何回かやった内のチャンピオンデータを論文などに載せるべきか、後者のように最低3回やったデータを合わせたものを載せるべきか、と疑問に思いました。

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