BioTechnicalフォーラム [ウエスタンブロットについて]

ウエスタンブロットについて

No.12141-TOPIC - 2024/02/06 (火) 22:28:49 - mel

いつも勉強していただいております大学院生です。

普段WBする際、例えばターゲットが60ｋDaであるとき、
1次抗体を当てる前に、45kDaあたりでメンブレンをカットし、
上側でターゲット、下側でGAPDHなどのローディングコントロールを検出していますが、
一般的にはまずフルメンブレンでターゲットを検出し、その後ストリッピングしてローディングコントロールを検出するという方法が正しいのでしょうか。

論文でフルブロット画像を要求されることから、このやり方を勧められました。
　

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No.12141-14 - 2024/02/08 (木) 09:48:05 - おお

JCIは必ずRawデーターというか全体のイメージの提出をもてめてます。

https://www.jci.org/articles/view/162533/sd/2

上記リンクのようにまあ切ったやつの全体イメージを出しているペーパーもあります。

(無題)

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No.12141-13 - 2024/02/08 (木) 08:57:30 - ねずみ

オリジナルのデータを提出させる出版社側の意図としては、不正（画像の使い回しなど）を見抜きやすいから、だと思われます。つまり、使い回しが疑われる場合にその他の箇所の汚れや非特異シグナルやメンブレンの形状などを材料にして”画像の使い回し”かどうかの判断ができるということです。ですので、全面のデータを提出するのがすべての雑誌においての要求に完璧に答える事ができるやり方でしょう（全面データを提出せよと明確に指示している雑誌もあるかもしれません）。しかし、現実的には切ったメンブレンで取得した画像をオリジナルデータとしてsupple.で提出しているケースも多いと思います。
個人的には全面を使うのが好みなのでリプロービングして複数の抗体で検出しますが、ストリッピングすると定量性が下がるとも言われているので定量性が重要なときは2枚（もしくは1枚のゲルの左半分／右半分）でやったりします。

(無題)

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No.12141-12 - 2024/02/07 (水) 21:56:59 - JJJ

後半に書かれたやり方が正しい方法です。ただ前半に書かれてるようなやり方してる人も割といますしそのような形のデータが論文に掲載されていることもあります。でもこれだと切り取ったメンブレンの範囲に何があるかわからないままなので、データとしては不完全です。
投稿してリビジョンで改良の指摘されて、また実験をやり直す手間考えれば、普通にリプロービングした方が良いと思います。

(無題)

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No.12141-11 - 2024/02/07 (水) 19:15:41 - G25

>それを全てのデータでやれとなると現実問題コストとか手間の問題もあるので必ずしも全ての抗体、WBで全面を確認せねばならないというものでもないとは思う。

しらんけど、投稿データに関してはそうしてデータを取るべき。
ルーチンに切り刻んだブロットでやっているとしても、投稿用にデータを取り直す覚悟なら構わないと思う。

(無題)

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No.12141-10 - 2024/02/07 (水) 18:41:12 - おお

>[Re:9] melさんは書きました :
> 質問者です。

>
> １点気になったのが、
> ローディングコントロール用にカットしたものはターゲットの１次抗体をあてていないので、
> 要求された後に、合わせて提出してもあまり意味がないように思いました。

インターナルコントロール用の方という事ですよね。膜全体のイメージを示す理由は昨今学術的な意味合いより、残念ながら不正防止の意味合いが強くなってきています。なのでインターナルコントロール用の方も出すのが筋だと思います。

(無題)

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No.12141-9 - 2024/02/07 (水) 18:24:05 - mel

質問者です。
皆様ありがとうございます、大変勉強になりました。

まとめますと、
フルメンブレンのデータがあるに越したことはないが、カットする方法が悪いわけではなく、
抗体の信頼性、修飾の可能性、コスト、手間など勘案し総合的に判断するのがよいということでしょうか。

１点気になったのが、
ローディングコントロール用にカットしたものはターゲットの１次抗体をあてていないので、
要求された後に、合わせて提出してもあまり意味がないように思いました。

(無題)

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No.12141-8 - 2024/02/07 (水) 17:11:33 - asan

>論文のfigの都合上、目的のバンドの周辺部分だけ画像を切り取って載せることもあるかと思いますが、それはあくまでもブロット全体の像があってのことで、要求されればそれも提示できなければいけないでしょう。ジャーナルによっては補助データとして画像編集前の生画像を添付するように要求するところもありますよね。

そりゃそうなんだが、質問は「その生データでは必ず全面データを取らなければいけないのか?」ということだと思う。
それを全てのデータでやれとなると現実問題コストとか手間の問題もあるので必ずしも全ての抗体、WBで全面を確認せねばならないというものでもないとは思う。
実際NCBとかは昔からSupplにuncropped imageをのせてるが、必ずしも切り取ってない訳ではないし、要は抗体やデータの信頼性が低い場合に、極めて合理的な指摘なら対応する必要があるという話だと思う。過去に複数の論文で使われてるよい抗体で、想定通りの位置にその通りでてるならば特に咎める必要もない。逆に、新しい抗体でーとか、そのWBのデータがその他の結果と矛盾する可能性があって、もしかしたらそのバンドの検出が良くないのではないかという指摘なら妥当だと思う。結局ピアレビューというシステムである以上、最低限生データーがあるのは絶対だが、それ以上は状況に応じて必要なデータの取り方をすべきというしかない。

たとえば、qPCRだってddCT使う前に前提となる検量線をかいて、ちゃんと線形性がある範囲でそれを複数回行って十分使えることを確認した上で初めて全ての論文で使ってるかといえばそうでないものも多いでしょう。嘘かもしれないデータを積極的に横着して載せるのはどうかと思うが、何かしらの科学的に妥当な根拠や考えを持ってやってるならその範囲では有効なデータの取り方は一つではないと思う。

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No.12141-7 - 2024/02/07 (水) 10:58:38 - G25

目的のバンドを含む部分だけ切り取っているというのは、恣意的にトリミングするという行為にほかならないのではないでしょうか。不都合なシグナルを恣意的に除去するのと変わらない。切り離した部分にはシグナルがないならないで、それが第三者にも確認できるようにするべきで、余計な手を加えないほうがいいんじゃないかな。

論文のfigの都合上、目的のバンドの周辺部分だけ画像を切り取って載せることもあるかと思いますが、それはあくまでもブロット全体の像があってのことで、要求されればそれも提示できなければいけないでしょう。ジャーナルによっては補助データとして画像編集前の生画像を添付するように要求するところもありますよね。

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No.12141-6 - 2024/02/07 (水) 10:38:45 - asan

バンドサイズマーカーは実際のサイズと若干のずれがあると言われてるので、ギリギリを切るとみせたくない近くのバンドを意図的に隠してると思われる場合はありますね。そのため、多少の上下の幅を持たせておくべきだとは思いますが、必ずしも全面で1つの抗体で染色しなくてはいけないということでもないと思います。

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No.12141-5 - 2024/02/07 (水) 08:32:36 - TS

> 論文でフルブロット画像を要求されることから、このやり方を勧められました。
これがある場合は仕方ないですね。
あるいは分解産物を見ておく必要があるとか他の目的があれば。

わたしは特段の理由がなければ、1回目からカットします。どこに出るか正確には確かではないので若干大きめに切りますが。一応見ておく程度で、フルメンブレンで他のところにもバンドが出た場合、なにかするのか？その抗体を使うのをやめるのか？って考えたとき、私はたぶん、目的バンドが出ていれば何もしないので。一方で、その目的バンドが本当に標的かどうかなどの検証は必要に応じて実施します。こっちの方がむしろ重要じゃないかなと。

>カットしてフルブロット画像を要求されたらカットした状態のフルブロット画像を出せばいいです

これも基本的に同意です。それでもだめって言われたら仕方ないですが。

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No.12141-4 - 2024/02/07 (水) 03:01:37 - まりも

>[Re:1] melさんは書きました :
> 1次抗体を当てる前に、45kDaあたりでメンブレンをカットし、
> 一般的にはまずフルメンブレンでターゲットを検出し、その後ストリッピングしてローディングコントロールを検出するという方法が正しいのでしょうか。
どちらでもいいです。

> 論文でフルブロット画像を要求されることから、このやり方を勧められました。
カットしてフルブロット画像を要求されたらカットした状態のフルブロット画像を出せばいいです。

(無題)

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No.12141-3 - 2024/02/07 (水) 02:57:37 - おお

>[Re:1] melさんは書きました :

>...が正しいのでしょうか。
どれが正しいとかはありません。

> 論文でフルブロット画像を要求されることから、このやり方を勧められました。

これは取得したイメージの全体像ということではなかろうか。もちろん抗体の評価、目的のサイズ以外のバンド（１００％ノンスペということはないので）の有無など最初に確認すべきという観点もあるでしょうけど。

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No.12141-2 - 2024/02/07 (水) 00:37:39 - たこ

正しいかどうかはケースバイケースのように感じます。
当方少なくとも１回はフルで検出してますが。
60 kDaのほうのタンパク質のスプライシングバリアントなりプロセシングに生理的意味があるなら当然切らない方がいいですよね。
まあめんどくさいかもしれないですが、journalにフルでの画像と指定されていて、要求されるならそうするのも致し方ないかもしれないですね。
個人的にはあまり好きではないですが、結構周りにいるのが1次抗体をミックスして検出という方法。
１次抗体のhostが異なるなら、２次抗体を過酸化水素なりazideでHRP潰してloading controlの方をあてる。
１次抗体のhostが同じなら、2-ME、SDSのストリッピングバッファーでひっぺがす。

ウエスタンブロットについて

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No.12141-1 - 2024/02/06 (火) 22:28:49 - mel

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