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(無題) 削除/引用 No.12164-9 - 2024/02/22 (木) 11:54:33 - sss >[Re:7] おおさんは書きました : > >先行研究では、2~5時間やover nightなどまちまちのような気がします。 > > その研究にあったタイミングもあるでしょうけど、細胞の性質は（特にCell line）、研究室ごとにいくらか性質にブレが出たりします。その細胞を使っている研究室の数だけ同じ名前の違う細胞があると大げさなことをむかしいったような気がします。なので最初は試行錯誤するかいくらか条件を振っていい条件を見つけるというのはまあまああることだと思います。もちろん文献をみて条件をきめてそのまますんなり行くケースも少なくはないと思いますけど。 おお様 やはり、条件を振って条件検討をしていくのが無難なようですね。 文献も参考にしつつ、試行錯誤していきます。

(無題) 削除/引用 No.12164-8 - 2024/02/22 (木) 11:50:55 - sss >[Re:6] SNさんは書きました : > ちなみに無血清にはどのタイミングでしているのですか？タンパク添加群と同じタイミングですか？ SN様 細胞を播種し、10%FBS含有D-MEM培地で24h培養後になります。 無血清培地のみの群、タンパク添加群共に同じタイミングで培地交換を行なっております。 ちなみにタンパクのみの効果を反映させたいため、分化誘導剤等は使用しておりません。

(無題) 削除/引用 No.12164-7 - 2024/02/22 (木) 02:47:01 - おお >先行研究では、2~5時間やover nightなどまちまちのような気がします。 その研究にあったタイミングもあるでしょうけど、細胞の性質は（特にCell line）、研究室ごとにいくらか性質にブレが出たりします。その細胞を使っている研究室の数だけ同じ名前の違う細胞があると大げさなことをむかしいったような気がします。なので最初は試行錯誤するかいくらか条件を振っていい条件を見つけるというのはまあまああることだと思います。もちろん文献をみて条件をきめてそのまますんなり行くケースも少なくはないと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.12164-6 - 2024/02/22 (木) 02:02:18 - SN ちなみに無血清にはどのタイミングでしているのですか？タンパク添加群と同じタイミングですか？

(無題) 削除/引用 No.12164-5 - 2024/02/21 (水) 14:49:24 - sss おお様 SN様 ご回答ありがとうございます。 私が神経突起の伸長を確認した条件では,serum-freeの培地に±とあるタンパク, ７２時間培養で行いました。 タンパク添加群は非添加群に比べ約４０%ほど神経突起長が増加することが確認できています。 おお様 血清飢餓培養の条件検討を参考にしてみます。 上記の通り、無血清の培地においてタンパクを添加し、神経突起長の増加が確認できていますので、p-Erkなど、その他リン酸化タンパクのリン酸化レベルをWBで比較することは可能だと考えております。 SN様 上記の通り、神経突起長の増加は無血清培地の条件で確認できました。 MAPK以外のシグナル経路も考えられるとは思いますが、MAPK阻害剤の添加も検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.12164-4 - 2024/02/20 (火) 04:31:21 - おお ちょっと余計な口出しかもしれませんが、血清を抜いてMAPKの活性を抑えると神経突起の伸長が見られるなら、その細胞においてMAPKの活性は神経突起の伸長にあまり影響がないということになりますよね。。。もちろん質問されている方の実験を把握していないで、質問の内容だけのうわべだけの判断ですけど。神経突起の伸長もおそらく多段階あると思えますので（初期神経突起の形成、伸長など）そのへんも考慮に入れているのかもしれません。 もし血清を抜いて、更にその蛋白を加えれば神経突起の伸長が明らかに増強されるのならたとえ血清を抜いて神経突起の伸長が見られても、血清を抜いた状態と、その状況でその蛋白を加えた状態で比較することはできると思います。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10694225/ こちらの実験では、血清を抜いて５日ぐらい培養してますが神経突起の伸長がある程度見られ、血清を抜いた状態で更に刺激を加えた状況と比較しています。その刺激で神経突起の伸長が増強されているようです。たしか血清を抜いてと書きましたが１％ぐらい入っている状況で維持されていたと思います。WBでp-ERK1/2のシグナルが明らかに１％血清で抑制されています。

(無題) 削除/引用 No.12164-3 - 2024/02/19 (月) 12:31:58 - SN 大脳皮質由来の初代培養神経細胞を用いて神経栄養因子刺激によるMAPKを見ていた実験では、特に血清飢餓は行なっていませんでした。B-27 supplementを使わない系だったので、培養翌日に10%から5%に減らして、1週間後に神経栄養因子で刺激していました。 神経突起の伸長が見られた条件では血清飢餓は行なっているのですか？ MAPKを介していると考えられるなら、同じ条件でMAPKは活性化されると思うのですが（検出しづらいなどの可能性はありますが）。 神経突起の伸長が確実に見れているのなら、MAPK阻害剤を用いても良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12164-2 - 2024/02/15 (木) 16:08:59 - おお https://www.nature.com/articles/s41598-018-32316-2 図4 この実験では血清抜いて4時間で顕著な活性化ERKの減少が認められている。 細胞や実験系によって同様の結果になるとは限らないので、予備実験してみるといいかと。

神経系細胞の血清飢餓培養 削除/引用 No.12164-1 - 2024/02/15 (木) 13:29:30 - sss ある神経系細胞の神経突起伸長について研究している者です。 細胞にあるタンパクを添加し、神経突起の伸長に影響がある結果が得られたので、MAPKシグナルのリン酸化レベルを計りたいと思いタンパク抽出の条件検討を行なっております。 培養時、細胞内のすでに活性化されているタンパクを不活性化させるため、血清飢餓培養をおこなっていますが、培養時間がどれくらいがいいのかわかりません。先行研究では、2~5時間やover nightなどまちまちのような気がします。 神経系細胞では、血清飢餓培養を長時間行うと、分化し始め、突起が伸びてきます。なので私の研究は神経突起伸長に関することでありますので長時間の血清飢餓培養は不適なような気がします。 神経系細胞における、リン酸化タンパク抽出の飢餓培養の時間についてご教授お願い致します。

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