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(無題) 削除/引用 No.12181-12 - 2024/02/21 (水) 12:54:04 - G25 一応、申し添えると、 電気溶出　electro-elutionという手法があって、各種実験書にも載っているしネットでもプロトコールが見つかるだろう。 概略は切り出したゲルを泳動バッファとともに透析膜に封じて、サブマリン電気泳動にかけ、透析膜内のバッファを回収する。透析膜の代わりに市販の器具もある。 切り出すバンドの可視化には、大腸菌に発現させたタンパク質のように十分に量が目的のバンドが容易に見分けられる場合、ゲルを濃いKCl溶液につけ冷蔵庫で冷やすという方法がある。ゲルの中でタンパク質が塩析して白濁する。

(無題) 削除/引用 No.12181-11 - 2024/02/21 (水) 03:36:19 - おお >[Re:10] うどんさんは書きました : > バイオマッシャー等で潰したのちにそのままウェルにアプライしてみたいと思います。 > ありがとうございます。 > うまく潰せたらいいのだけど、結構PAGEはゴムみたいな感じで崩れにくいし、、、 ゲルをそのまま乗せるなら、DTT入のサンプルバッファーに５分ぐらいつけておけばS-Sは外れる。きになるなら多少加熱してもいいけど。

(無題) 削除/引用 No.12181-10 - 2024/02/20 (火) 18:55:25 - うどん >[Re:3] 774Rさんは書きました : > 回収したゲルをみじん切りにして次の泳動のウェルに詰め込めないだろうか？ > 回収に拘るなら、電場の中にゲルを置き、透析チューブの中に回収する方法がある。昔は免疫用のタンパク質を泳動で分離精製するために、専用の機器を手作りして使っていた。 バイオマッシャー等で潰したのちにそのままウェルにアプライしてみたいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12181-9 - 2024/02/20 (火) 18:53:28 - うどん >[Re:4] TSさんは書きました : > AB-1171 アトプレップMF > https://www.atto.co.jp/products/reagents2/gelstainingsolution/AB-1171 > > 以前使ってました。 > 私の場合は、回収率はほぼ100％でした。 > サンプルがもらえるかもしれません。 サンプルを注文できそうでしたので注文してみたいと思います ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.12181-8 - 2024/02/20 (火) 18:52:06 - うどん >[Re:5] おおさんは書きました : > ゲルごと流す。 > そのバンドのところでもいいし、レーンをそのまま横にして流してもいいでしょう。例えば1mmの厚さのゲルで流して、二次元目は1.5mmにすればい。 > > https://en.wikipedia.org/wiki/SDS-PAGE > ここのコームの写真の一番上のようなものがレーンを横にして流すのに便利。だけどなくてもなんとかならなくはない。 > > 横にしてセットしたゲルは、浮いてきやすいにで、0.6%ぐらいのアガロースをスッタックゲルバッファーで溶かし、流し込んでゲル化してから泳動すれば良い。 ありがとうございます。 勉強不足で、ゲルをそのまま泳動して分離することができるのは知りませんでした。 実際に行ってみたいと思います！

(無題) 削除/引用 No.12181-7 - 2024/02/20 (火) 18:48:24 - うどん >[Re:2] よっしーさんは書きました : > 目的が良く分からないので，使えるのかどうかわかりませんが，複合体の解析などでしたらinvitrogenが昔よく宣伝していたblue-native PAGEの2Dは使えませんか？ > > https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/blue-native-page-ts-1/ ありがとうございます。 おっしゃる通り、複合体についての解析が行いたかったので、こちらのプロトコルの2Dを参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.12181-5 - 2024/02/20 (火) 17:25:00 - おお ゲルごと流す。 そのバンドのところでもいいし、レーンをそのまま横にして流してもいいでしょう。例えば1mmの厚さのゲルで流して、二次元目は1.5mmにすればい。 https://en.wikipedia.org/wiki/SDS-PAGE ここのコームの写真の一番上のようなものがレーンを横にして流すのに便利。だけどなくてもなんとかならなくはない。 横にしてセットしたゲルは、浮いてきやすいにで、0.6%ぐらいのアガロースをスッタックゲルバッファーで溶かし、流し込んでゲル化してから泳動すれば良い。

(無題) 削除/引用 No.12181-4 - 2024/02/20 (火) 16:49:13 - TS AB-1171 アトプレップMF https://www.atto.co.jp/products/reagents2/gelstainingsolution/AB-1171 以前使ってました。 私の場合は、回収率はほぼ100％でした。 サンプルがもらえるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12181-3 - 2024/02/20 (火) 16:46:07 - 774R 回収したゲルをみじん切りにして次の泳動のウェルに詰め込めないだろうか？ 回収に拘るなら、電場の中にゲルを置き、透析チューブの中に回収する方法がある。昔は免疫用のタンパク質を泳動で分離精製するために、専用の機器を手作りして使っていた。

(無題) 削除/引用 No.12181-2 - 2024/02/20 (火) 16:45:28 - よっしー 目的が良く分からないので，使えるのかどうかわかりませんが，複合体の解析などでしたらinvitrogenが昔よく宣伝していたblue-native PAGEの2Dは使えませんか？ https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/blue-native-page-ts-1/

アクリルアミドゲルからのタンパク質抽出 削除/引用 No.12181-1 - 2024/02/20 (火) 16:24:24 - うどん 非還元条件下で行ったSDS-PAGEゲルからタンパク質を抽出し、還元状態で再度SDS-PAGEを行いたいのですが、タンパク質抽出の回収率が悪くうまくいきません。 現在やっている方法としては、SDS-PAGE後のゲルをCBB染色せずに、切り出したのち1%SDS、20mMTris-HCl溶液(200uL)に浸しオーバーナイトで攪拌し抽出しています。 抽出溶液の上清を用いて還元状態のSDS-PAGEを行なっていますが、泳動後のゲルをCBB染色で確認したところ1ug程度しか回収できていないようです。 タンパク質を高収率で回収できる方法が他にもありましたらご教授いただけると嬉しいです。 よろしくおねがいいたします。

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